外周造血干細胞采集與凍存質(zhì)量分析

　　方法選取本院2014年7月至2016年7月收治的41例自體外周造血干細胞移植患者為研究對象，經(jīng)化療聯(lián)合粒細胞集落刺激因子進行造血干細胞動員，應(yīng)用血細胞分離機進行86例次自體外周造血干細胞采集，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測干細胞含量，采用以羥乙基淀粉為主的凍存體系，定期檢測干細胞活率，結(jié)合自體干細胞移植的成功率，評價造血干細胞采集及凍存的有效性和安全性。

　　結(jié)果化療間歇第9～11天，CD34+≥15個/μl，達到采集標準；經(jīng)1～3次采集CD34+細胞≥2×106/kg，單個核細胞數(shù)≥2×108/kg，符合自體干細胞移植標準；1～6個月凍存活率≥94%，回輸前1周復測干細胞活率≥96%。移植后平均＋9天粒系植入，平均＋13天巨核系植入。中位隨訪12個月，患者無病生存率達98%。

　　結(jié)論自體外周造血干細胞采集凍存質(zhì)量符合標準，為自體造血干細胞植活及移植的成功提供了根本保障。

　　關(guān)鍵詞造血干細胞移植；外周造血干細胞；干細胞采集；干細胞凍存

　　外周血造血干細胞移植是根治惡性血液病的有效手段。針對惡性淋巴瘤、骨髓瘤及無人類白細胞抗原配型相合供者的患者，自體外周造血干細胞移植（autologousperipheralbloodstemcelltransplantation，APBSCT）可作為治療的選擇之一[1]。其優(yōu)勢在于移植后并發(fā)癥少，成功率高，治療費用經(jīng)濟，無排異風險。自體外周造血干細胞的采集數(shù)量、凍存質(zhì)量及活率是決定APBSCT成功的重要因素。本院2014年7月至2016年7月完成了86例次自體造血干細胞的采集及凍存，筆者將41例患者的86例次采集結(jié)果全部納入本研究進行分析，以監(jiān)測自體外周造血干細胞采集與凍存質(zhì)量，提高自體造血干細胞移植的療效。

　　1、資料與方法

　　1.1、一般資料

　　選取本院2014年7月至2016年7月收治的41例APBSCT患者為研究對象，完成自體外周造血干細胞采集86例次；男25例，女16例；年齡15～59歲，平均37歲；其中非霍奇金淋巴瘤18例，多發(fā)性骨髓瘤14例，霍奇金淋巴瘤4例，急性白血病3例，POEMS綜合征2例。

　　1.2、干細胞動員

　　采用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）化療聯(lián)合粒細胞集落刺激因子（colonystimulatingfactor，G-CSF）方案動員。CTX使用方法為2～3g/m2單次或分2日靜脈滴注，G-CSF通常在化療間歇期第5～7天，白細胞計數(shù)降至最低點時應(yīng)用。G-CSF每日用量為5～10μg/kg，分早晚兩次皮下注射，持續(xù)使用至采集當日清晨。每日監(jiān)測血常規(guī)及外周血CD34+計數(shù)，當CD34+≥15個/μl即達到采集標準。

　　1.3、采集前準備

　　1.3.1、患者準備

　　采集前一周食用高蛋白、高維生素飲食，采集前一晚開始改用低脂飲食，禁忌空腹。提前做好皮膚清潔，保持充足睡眠。暫停使用影響凝血功能的藥物。

　　1.3.2、血管評估及置管

　　采集前需評估血管情況，以粗直彈性良好的肘部血管（肘正中靜脈、頭靜脈、貴要靜脈）為首選。如肘部血管不理想，需進行股雙腔中心靜脈置管（型號為PVC11.5FR），以保證較好的采集壓力及流速。

　　1.4、外周造血干細胞采集

　　1.4.1、儀器與管路

　　采用SpectraOptia血細胞分離機（TerumoBCT公司）7.2版本軟件及一次性使用血細胞收集管路（TerumoBCT公司）。

　　1.4.2、干細胞采集過程

　　提前做好采集室環(huán)境及被服消毒，檢測血細胞分離器性能是否完好，選擇單個核細胞采集程序。建立2條靜脈通路，以收集管路自帶鋼針或股中心靜脈作為出路，密閉式靜脈留置針（BD竸瑪型號18G）建立回路。啟動預沖，抗凝劑為血液保存液Ⅰ（ACD-A配方抗凝劑），速率為1.5～4.9ml/min。全血與抗凝劑比例為（10～12）︰1，采血流速為27.2～58ml/min。一般成人全血容量為3076～6768ml，循環(huán)血量設(shè)置為全血容量的2～3倍，約8510～14000ml，采集物體積為108～552ml。采集時間為4～7小時，因時間較長需保證患者舒適體位，協(xié)助完成大小便及飲食等生活需要，避免進食含水量多的食物，減少因排尿造成體位改變影響采集壓力。采集前3天口服碳酸鈣D3片（批號：國藥準字H10950029；規(guī)格：每片含鈣600mg/維生素D3）每日2片。采集過程中密切觀察患者的生命體征，每2小時口服葡萄糖酸鈣注射液（批號：國藥準字1160928103；規(guī)格10ml﹕1g）20ml，必要時以葡萄糖酸鈣注射液20ml加入0.9%氯化鈉注射液500ml中與采集同步滴注，防止發(fā)生低血鈣反應(yīng)。

　　1.4.3、采集后護理

　　拔管后，做好穿刺部位的護理；患者平躺15～30分鐘，起床動作需緩慢，自覺口渴或饑餓應(yīng)進食，防止發(fā)生低血糖。建議休息1周，禁止從事重體力勞動，加強營養(yǎng)攝入。

　　1.5、干細胞凍存與活率監(jiān)測

　　凍存液配置方法：終濃度5%羥乙基淀粉（hydroxyethylstarch，HES）＋10%二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）＋15%人血清白蛋白。凍存液與干細胞比例為2︰1，40ml分裝為1袋。置于-80℃環(huán)境中冷凍保存，分別于每個月及干細胞回輸前1周、3天、1天監(jiān)測樣本活率。經(jīng)37℃水浴復蘇后將干細胞快速回輸至患者體內(nèi)?；剌敽蟮?天標記為自體造血干細胞移植＋1天。

　　2、結(jié)果

　　2.1、干細胞動員效果

　　干細胞動員過程中，23例患者無任何不適，18例患者出現(xiàn)低熱、頭痛、腰背肌肉酸痛等不適反應(yīng)。干細胞采集當天外周血細胞計數(shù)均值如下：白細胞為（27.56±14.36）×109/L，血紅蛋白為（110±19）g/L，血小板為（130±80）×109/L，血細胞比容為（33.7±5.4）%。干細胞動員后CD34+百分比見圖1，CD34+細胞平均值見圖2。平均于化療間歇第9～11天進行細胞動員，動員后4～6天內(nèi)CD34+細胞數(shù)目達到采集標準。

　　2.2、造血干細胞采集質(zhì)量

　　經(jīng)1～3次采集后，采集物CD34+細胞數(shù)≥2×106/kg，單個核細胞數(shù)≥2×108/kg，符合APBSCT要求。41例患者的86例次自體外周造血干細胞采集中8例患者1次采集達標，21例患者2次采集達標，12例患者3次采集達標。單次采集質(zhì)量分析，采集物體積為（276.5±102.4）ml，單個核細胞含量為（4.6±3.3）×108/kg，CD34+細胞含量為（3.8±3.0）×106/kg，采集物CD34+百分比為（0.4±0.3）%。

　　2.3、自體造血干細胞凍存活率監(jiān)測

　　凍存1～6個月，干細胞凍存活率≥94%。分別于回輸前1周、3天、1天監(jiān)測干細胞凍存活率，結(jié)果顯示干細胞凍存活率≥96%（圖3）。

　　2.4、采集的不良反應(yīng)及處理

　　本研究中86例次自體外周干細胞采集，發(fā)生枸櫞酸鈉不良反應(yīng)12例次，其中1例次出現(xiàn)胸悶、惡心、嘔吐癥狀，其余表現(xiàn)為口唇及指尖麻木。經(jīng)過積極補鈣對癥處理，所有不良反應(yīng)均于采集后4小時內(nèi)消失。

　　2.5、血管通路選擇

　　36%的自體造血干細胞采集患者使用了股中心靜脈置管。

　　2.6、異常報警及處理

　　釆血壓力不足是血細胞分離機采集運行中的常見報警原因。5例次自體干細胞采集出現(xiàn)壓力報警，予以穿刺部位熱敷加壓、調(diào)整針尖位置、生理鹽水沖管等方法使采集壓力得到有效改善。1例次出現(xiàn)干細胞收集器堵管，調(diào)整全血與抗凝劑比例為8︰1后，凝塊逐漸溶解。所有異常報警均于3分鐘內(nèi)處理完畢，采集效果未受影響。

　　2.7、自體外周造血干細胞移植后造血重建及生存情況

　　41例APBSCT患者在干細胞回輸后2周內(nèi)均獲得造血重建，粒系植入時間為回輸后第7～12天，平均第9天；巨核系植入時間為回輸后第11～16天，平均第13天。隨訪2～22個月，中位隨訪時間為12個月，1例患者在移植后4個月復發(fā)死亡，其余患者均未出現(xiàn)移植復發(fā)死亡，中位無病生存率為98%。

　　3、討論

　　自體造血干細胞移植是目前能夠使血液系統(tǒng)惡性疾?。ㄈ绨籽　⒘馨土?、骨髓瘤等）患者長期存活的治療手段之一。預處理方案是造血干細胞移植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其在盡可能殺傷腫瘤細胞的同時，也損傷了正常的造血組織和造血細胞。移植前采集和凍存高質(zhì)量的外周造血干細胞，才能保證移植患者的安全，促進造血重建，是移植成功的重要保障，因此造血干細胞有效的采集和凍存方法是移植成功的關(guān)鍵因素。

　　首先，股中心靜脈置管是保證造血干細胞順利采集的重要條件。由于自體造血干細胞采集者常在采集前接受過若干療程化療，血管受到一定損傷[2]，外周靜脈穿刺極為困難。因此，尋找合適的血管是保證順利采集的關(guān)鍵因素。對于血管條件不理想者，為減少其因反復穿刺造成的緊張情緒和痛苦感，常以股雙腔中心靜脈置管作為通路。因股靜脈容易穿刺，且雙腔導管管徑大，血流充足，管壁較厚，不會在抽吸過程中發(fā)生管路塌陷[3]，可以保證良好的采集及回流壓力，提高外周造血干細胞采集效率。本研究結(jié)果顯示，在干細胞動員后第2天，外周造血干細胞含量和百分比逐步升高，65%的患者在動員5天內(nèi)達到采集要求，動員過程中44%的患者出現(xiàn)輕微不適，動員結(jié)束后癥狀消失，動員效果未受到影響。提示該動員方案可作為自體干細胞動員采集的常規(guī)方案。隨著動員時間和采集次數(shù)的增多，患者外周造血干細胞的含量呈下降趨勢，因此，應(yīng)在動員后第4～6天內(nèi)完成外周造血干細胞采集。

　　采用SpectraOptia血細胞分離機進行外周造血干細胞采集，界面操作簡單，指導方式清晰易行，采集效率高。多數(shù)研究認為CD34+細胞數(shù)≥2×106/kg是移植成功的閾值[2，4]，本院自體外周干細胞采集1～3次可達到移植要求，干細胞采集后血小板平均下降35.7%[5]。因此，SpectraOptia血細胞分離機是簡單便捷的采集儀器之一。外周造血干細胞采集與骨髓采集相比，創(chuàng)傷小，避免了硬膜外麻醉并發(fā)癥及術(shù)中失血、感染、損傷等危險因素，安全可行。抗凝劑枸櫞酸鈉的不良反應(yīng)是采集中最常見的不良反應(yīng)之一。常見表現(xiàn)為口周、面部或肢體末端麻木、惡心、嘔吐、胸悶等。原因是枸櫞酸鈉螯合血液中鈣離子，形成不能離子化的枸櫞酸鈣，引起血液中鈣離子水平下降[6]。不良反應(yīng)以低血鈣反應(yīng)為主，癥狀輕微，患者可耐受。

　　外周造血干細胞的凍存液的組合有多種，如終濃度為3.5%DMSO＋1%人血清白蛋白＋2.5%HES[7]或10%DMSO＋8%人血清白蛋白＋12%HES[8]，也可以自體血漿代替人血白蛋白[9]，DMSO的濃度亦各不相同[10]，但合理的組合都會達到良好的長期凍存效果，并不影響自體造血干細胞的植入和造血恢復[11-13]。本院采用的以HES為主的凍存體系，方法便捷，價格低廉。干細胞活率監(jiān)測簡單易行，凍存1～6個月其活率可保證在94%以上。因此該凍存方法值得推廣。應(yīng)用本凍存方法凍存的外周血造血干細胞，其移植療效與文獻報道的淋巴瘤與多發(fā)性骨髓瘤自體造血干細胞移植的無病生存率吻合[14，15]。

　　綜上所述，本院造血干細胞的采集和凍存方法顯示出良好的安全性，為APBSCT的成功奠定了良好基礎(chǔ)。