最受關(guān)注的基因編輯技術(shù)是什么？CRISPR！其中走得最快的系統(tǒng)是哪個(gè)？CRISPR/Cas9！

近幾年來(lái)，科學(xué)家不斷對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行改造，更敏感的檢測(cè)方法、更高效的Cas9酶、更好的遞送方式……與臨床之間的天塹鴻溝——脫靶效應(yīng)，在研究者的努力下已經(jīng)變得不那么可怕，使用CRISPR/Cas9進(jìn)行的第一批臨床試驗(yàn)也提上了日程。

稍等，CRISPR/Cas9真的如我們所想的那樣安全嗎？繼上個(gè)月的致癌疑云之后，本周《自然生物技術(shù)》又曝新問(wèn)題，由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂修復(fù)，極有可能造成切割位點(diǎn)遠(yuǎn)端DNA大片段丟失、乃至其他更為復(fù)雜的基因突變[1]！

這種負(fù)面影響，一是丟失片段很長(zhǎng)，可高達(dá)數(shù)千bp，可能影響細(xì)胞功能；一是距離切割位點(diǎn)較遠(yuǎn)，可以位于20kb之外，正常評(píng)估流程難以檢測(cè)；一是隨機(jī)性強(qiáng)，每個(gè)樣本編輯后的基因型都有所不同，潛在影響的多樣化巨大！

該項(xiàng)研究來(lái)自英國(guó)惠康桑格研究所，人類基因組計(jì)劃中貢獻(xiàn)最大的科研機(jī)構(gòu)。文章通訊作者則是著名遺傳學(xué)家AllanBradley教授，他致力于癌癥與基因的研究，他擔(dān)任研究所長(zhǎng)期間重新調(diào)整了惠康桑格研究所的發(fā)展方向，研究所名下的十?dāng)?shù)個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)少不了他的功勞。[2]

一般來(lái)說(shuō)，科學(xué)家認(rèn)為Cas9導(dǎo)致的DNA修復(fù)不會(huì)造成20bp以上基因的插入和缺失[3-5]，不過(guò)實(shí)際上確實(shí)有研究曾發(fā)現(xiàn)，單gRNA誘導(dǎo)能夠在小鼠受精卵中造成600bp以上的基因缺失[6]，同時(shí)，雙gRNA誘導(dǎo)也表現(xiàn)出了比預(yù)期更加復(fù)雜的基因型改變[7]。

而且，在大多數(shù)研究中，對(duì)基因編輯結(jié)果的分析，往往只關(guān)注靶點(diǎn)和潛在脫靶位點(diǎn)周圍很小一段區(qū)域（<1kb），這樣很可能會(huì)錯(cuò)過(guò)一些并不連續(xù)的突變位點(diǎn)。再者，研究所使用的細(xì)胞往往來(lái)自癌細(xì)胞系，其基因組和DNA修復(fù)機(jī)制本來(lái)就不正常，結(jié)果是否能夠推廣到正常組織和細(xì)胞上也是個(gè)未知數(shù)。

Bradley教授和同事們認(rèn)為，可能有大量的編輯錯(cuò)誤我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，如果這些異?；蛭挥谡诨钴S增殖的細(xì)胞中，那么很有可能會(huì)導(dǎo)致其他疾病。

為了搞清楚這個(gè)問(wèn)題，研究者嘗試用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯雄性小鼠胚胎干細(xì)胞中的PigA基因。這個(gè)基因位于X染色體上，所以在XY細(xì)胞中沒(méi)有等位基因。

研究者首先嘗試了靶向基因外顯子的單gRNA，編輯效率還是很高的，59-97%的細(xì)胞PigA基因都喪失了功能。

然而奇怪的是，靶向內(nèi)含子的單gRNA也能夠?qū)е翽igA基因失活。要知道這些靶點(diǎn)距離外顯子還挺遠(yuǎn)，263-520bp之間的10個(gè)不同靶點(diǎn)編輯效率有8-20%，還有兩個(gè)靶點(diǎn)距離外顯子2kb開(kāi)外，居然也能導(dǎo)致5-7%的PigA失活！

為了搞清楚這過(guò)程中發(fā)生了什么，研究者對(duì)PigA缺陷細(xì)胞進(jìn)行了大規(guī)模測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶向內(nèi)含子的編輯，居然也會(huì)造成外顯子的缺失！也就是說(shuō)CRISPR會(huì)造成意料之外的遠(yuǎn)端DNA缺失！

研究者又繼續(xù)分離這些細(xì)胞挨個(gè)分析，發(fā)現(xiàn)將近四分之三的細(xì)胞（69/93）在切割位點(diǎn)和外顯子部分存在基因缺失，大小各不相同，最大能達(dá)到9.5kb；剩下的細(xì)胞則同時(shí)還有大片段插入等復(fù)雜的問(wèn)題。

值得注意的是，這些“病變”與目標(biāo)靶點(diǎn)并不相鄰，如果用通常的檢測(cè)方法，是根本無(wú)法發(fā)現(xiàn)的。

研究者還嘗試了從兩端同時(shí)擴(kuò)增來(lái)自部分缺陷細(xì)胞的PigA基因，結(jié)果只能得到兩端的序列，得不到中間部分。進(jìn)一步分析也顯示，存在著基因易位、倒錯(cuò)這樣更為嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)變異。

此外，細(xì)胞與細(xì)胞之間的基因缺失狀況又各有不同，這意味著潛在的致病模式多得無(wú)法想象。

鑒于實(shí)驗(yàn)中PigA是單等位基因，考慮到可能具有特殊性，研究者又選取了另一種基因Cd9，這種基因位于常染色體上，并不是胚胎干細(xì)胞生存必須的基因，它的表達(dá)產(chǎn)物也很容易被染色檢測(cè)。

重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示靶向外顯子的gRNA編輯效率達(dá)到88%，而靶向內(nèi)含子的編輯效率則在2.6-3.8%之間。考慮到破壞兩個(gè)等位基因才能夠阻止Cd9表達(dá)，這個(gè)結(jié)果實(shí)際上和PigA得到的基本一致。

測(cè)序結(jié)果也顯示，Cd9基因中存在大片段缺失，最長(zhǎng)達(dá)到5.5kb，而且27個(gè)Cd9缺陷細(xì)胞中，只有一個(gè)具有完整的外顯子。

那么是不是由于小鼠胚胎干細(xì)胞尚未分化，具有某些特性，所以才造成這些問(wèn)題的呢？同樣的實(shí)驗(yàn)又在永生化人女性視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系（RPE1）和小鼠造血祖細(xì)胞中進(jìn)行，結(jié)果也很相似。

轉(zhuǎn)染方式也并非關(guān)鍵，無(wú)論是PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，還是電穿孔和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，CRISPR/Cas9造成的這種大片段缺失都是存在的。

本項(xiàng)研究中使用了小鼠的胚胎干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和人成熟分化細(xì)胞，前兩者具有正常的DNA修復(fù)機(jī)制，而這三者都在臨床研究中有著應(yīng)用。

考慮到臨床，事情就更加嚴(yán)肅了。臨床中往往要一次性編輯數(shù)十億個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生的大量不同突變很可能是致病的病變，乃至救命的細(xì)胞變成的致命的腫瘤。

Bradley教授表示，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)“被嚴(yán)重低估了”，而本項(xiàng)研究“應(yīng)當(dāng)成為一記警鐘。”

這篇論文剛剛發(fā)表二十分鐘，業(yè)界領(lǐng)頭的CRISPR先驅(qū)們股價(jià)大跌，CRISPRTherapeutics股價(jià)下跌8.6%，EditasMedicine下跌7%，IntelliaTherapeutics下跌近10%。超過(guò)3億美元市值憑空蒸發(fā)。[8]

不過(guò)這些新貴們倒并不慌張，畢竟如果基因編輯真的會(huì)造成如此嚴(yán)重的后果，那么在鋅指或TALENs技術(shù)中也應(yīng)當(dāng)有體現(xiàn)——很顯然，并沒(méi)有人觀察到。

Intellia表示，他們一直在對(duì)小鼠編輯后基因組進(jìn)行分析，目前為止還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何“致癌”的突變。其副總裁TomBarnes表示，這可能是由于Bradley團(tuán)隊(duì)采用了積極增殖的細(xì)胞，而Intellia使用的細(xì)胞更為“靜止”[9]。

Editas則發(fā)布聲明表示，公司致力于基于CRISPR的藥物，并不會(huì)受到這項(xiàng)研究的影響。

現(xiàn)在的問(wèn)題和我們上個(gè)月討論的很類似了，如果這個(gè)現(xiàn)象是真的，那么我們?yōu)槭裁丛诖饲暗呐R床前實(shí)驗(yàn)中從未觀察到小鼠大規(guī)模爆發(fā)腫瘤呢？

至少目前可以確定，體外編輯細(xì)胞之后，做個(gè)全基因組測(cè)序恐怕很有必要。