大腸腫瘤是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來隨著人們生活方式與飲食習慣的改變，大腸癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢[1]。雖然關(guān)于大腸癌發(fā)病機制的研究不斷深入，但其確切病因仍不明確。目前關(guān)于腸道菌群狀態(tài)與大腸癌發(fā)病的研究日益受到關(guān)注，多項研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群狀態(tài)與大腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[2]。因此，研究腸道菌群的變化，對于了解其在大腸癌發(fā)病中的作用以及尋找大腸癌最佳治療方法具有重要意義。但目前研究多集中于腸道菌群在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用[3，4]，對于大腸癌患者、大腸腺瘤患者及正常人群腸道菌群的分類和定量研究還較少。本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）對研究對象的腸道菌群進行分類和定量研究，以明確腸道菌群的變化，為研究腸道菌群狀態(tài)與大腸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性提供依據(jù)。

　　1、資料與方法

　　1.1、一般資料

　　1.1.1、大腸癌組

　　將2015年1月至2016年3月于本院就診的45例大腸癌患者納入大腸癌組，納入標準：①符合大腸癌診斷標準[5]，并經(jīng)腸鏡及病理學檢查確診；②年齡40～80歲；③預期生存期＞3個月；④無結(jié)直腸手術(shù)史；⑤未經(jīng)過輔助放化療及手術(shù)治療；⑥身體狀況良好，未合并心、肝、腎及血液系統(tǒng)疾??；⑦無特殊飲食習慣；⑧對本研究知情同意。排除標準：①長期腹瀉患者；②曾接受結(jié)直腸放療患者；③家族性腺瘤性息肉?。╢amilialadenomatouspolyposis，F(xiàn)AP）或遺傳性非息肉性大腸癌（hereditarynonpolyp-osiscolorectalcancer，HNPCC）患者；④炎性腸?。╥nflammatoryboweldisease，IBD）、糖尿病或肥胖等代謝性疾病患者；⑤近1個月內(nèi)曾服用抗生素、皮質(zhì)類固醇、質(zhì)子泵抑制劑等藥物患者。入選患者中，男27例，女18例；年齡42～72歲，平均（61.7±6.6）歲；根據(jù)美國腫瘤聯(lián)合會（AmericanJointCommitteeonCancer，AJCC）/國際抗癌聯(lián)盟（UnionforInternationalCancerControl，UICC）第7版TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期17例，Ⅲ期14例，Ⅳ期5例；腫瘤位置：盲腸2例，升結(jié)腸4例，降結(jié)腸3例，乙狀結(jié)腸11例，直腸25例。

　　1.1.2、大腸腺瘤組

　　將2015年1月至2016年3月于本院就診的62例大腸腺瘤患者納入大腸腺瘤組，納入標準：①符合大腸腺瘤診斷標準[5]，并經(jīng)腸鏡及病理學檢查確診；②未合并心、肝、腎及血液系統(tǒng)疾??；③無結(jié)直腸手術(shù)史；④對本研究知情同意。排除標準：①長期腹瀉患者；②IBD、FAP、代謝性疾?。ㄌ悄虿　⒎逝值龋┗颊?；③近1個月內(nèi)曾服用抗生素、皮質(zhì)類固醇、質(zhì)子泵抑制劑等藥物的患者。入選患者中，男37例，女25例；年齡40～73歲，平均（63.2±7.1）歲；腺瘤類型：管狀腺瘤32例，絨毛狀腺瘤8例，管狀-絨毛腺瘤16例，鋸齒狀腺瘤6例。

　　1.1.3、對照組

　　將2015年1月至2016年3月本院體檢中心健康體檢者60例納入對照組，納入標準：①年齡40～80歲；②無消化道慢性疾病史，常規(guī)體檢及糞便常規(guī)檢查均無異常；③留取糞便標本前1個月內(nèi)未使用抗生素或微生態(tài)抑制劑；④對本研究知情同意。排除標準：①合并心、肝、腎及造血系統(tǒng)功能嚴重損害者；②病歷資料不完整者；③妊娠期或哺乳期女性；④合并精神疾病者。入選研究對象中，男35例，女25例；年齡40～76歲，平均（60.7±8.2）歲。三組研究對象一般資料比較均無顯著差異（P＞0.05），具有可比性。

　　1.1.4、標本采集

　　分別收集三組研究對象新鮮大便，以天平稱取中段大便，每份3g，存放于無菌離心管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2、實驗儀器及試劑

　　1.2.1、實驗儀器

　　離心管（德國Eppendorf公司）、低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、-80℃超低溫冰箱（美國ThermoForma公司）、核酸蛋白檢測儀（德國Eppendorf公司）、PCR擴增儀（美國BIO-RAD公司）、電泳儀PowerPAC3000（美國BIO-RAD公司）、凝膠成像分析系統(tǒng)GelDoc2000TM（美國BIO-RAD公司）、熒光定量PCR儀ABI7300（美國ABI公司）、熒光定量PCR儀LightCycler2.0（瑞士羅氏公司）。

　　1.2.2、實驗試劑

　　普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、瓊脂糖（美國Introvergen公司），DNA提取液（北京天根生化科技有限公司）、RNA酶抑制劑（北京天根生化科技有限公司）、OligodT18（北京天根生化科技有限公司）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxynucleotidetripho-sphates，dNTPs）（北京天根生化科技有限公司）、PowerSYBR?GreenPCRMasterMix（美國ABI公司），DNA分子標準Marker（加拿大Fermentas公司）。其他試劑：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）、乙醇、氯仿、異丙醇、氯仿-異戊醇（24︰1）均為國產(chǎn)分析純。

　　1.3、方法

　　1.3.1、引物的設(shè)計與合成

　　[6]參照文獻研究設(shè)計雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、梭菌屬、梭桿菌屬等引物，并以局部序列比對基本檢索工具（basiclocalalignmentsearchtool，BLAST）在線核實其特異性后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

　　1.3.2、糞便DNA的提取[7]

　　取0.5g糞便樣本加入10ml磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）（0.1mol/L）充分混勻，置于10ml離心管中，離心半徑225px，3000r/min離心5分鐘，取上清液，并重復上述離心操作3次后，取1ml上清液加入1.5ml離心管中，離心半徑350px，12000r/min離心10分鐘，棄上清液，于沉淀中再加入上述上清液，重復4次，收集沉淀。將預處理后收集的沉淀以磁珠擊打破碎細胞后，采用酚/氯仿抽提純化法提取DNA，以核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度及A260/A280。并采用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察DNA片段大小和完整性。

　　1.3.3、實時熒光定量PCR反應(yīng)

　　PCR反應(yīng)體系20μl：實時熒光定量PCRMasterMix（2×）10μl，上游引物（10μmol/L）1.0μl，下游引物（10μmol/L）1.0μl，cDNA模板（300ng/μl）2.0μl，加DEPC補足至20μl。將反應(yīng)體系瞬時離心，上機循環(huán)。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預變性10分鐘；95℃變性20秒，57℃雙歧桿菌退火（58℃乳酸桿菌退火、59℃大腸桿菌退火、60℃糞腸桿菌退火、61℃屎腸桿菌退火、59℃擬桿菌屬退火、60℃梭桿菌屬退火、61℃梭菌屬退火）10秒，68℃延伸40個循環(huán)，74℃延伸30秒。

　　每次試驗均設(shè)標準品與陰性對照，反應(yīng)完成后糞便標本所含細菌的拷貝數(shù)由LightCyclerPCR儀分析其循環(huán)閾值（Ct值），并與標準曲線比較，求得分辨樣本菌群的定量結(jié)果。

　　1.3.4、標準曲線的制作

　　取對照組研究對象分辨基因組DNA，分別用不同細菌的特異性引物進行擴增，25μl反應(yīng)體系：buffer（5×）4μl、dNTPs（10mmol/L）2μl、MgCl22.5μl、上游引物1.0μl、下游引物1.0μl、Tap酶（2.5U/μl）0.4μl、模板DNA2.0μl、最后加DEPC至25μl，以94℃預變性5分鐘、94℃變性40秒、57.2℃細菌退火30秒、72℃延伸1分鐘40個循環(huán)、72℃后延伸5分鐘，置-20℃保存。

　　取PCR反應(yīng)產(chǎn)物6μl與溴酚藍2.5μl混勻上樣，用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳結(jié)束后采用凝膠成像系統(tǒng)攝像，并將出現(xiàn)目標條帶的擴增產(chǎn)物采用DNA純化試劑盒進行純化，之后用核酸蛋白檢測儀測定目標基因濃度及OD260/280值。根據(jù)吸光度值與片段長度的關(guān)系計算基因拷貝數(shù)（copies/ml），然后將其稀釋成（10～109）copies/ml，用作標準品；將純化產(chǎn)物20μl及糞腸球菌上、下游引物各10μl送由南京凱基生物技術(shù)公司進行測序，并對純化產(chǎn)物進行熒光定量PCR，根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件自動分析Ct值，并生成標準曲線。

　　1.4、統(tǒng)計學方法

　　采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。標本定量數(shù)據(jù)以x±s表示，研究對象各組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，大腸癌與菌群相關(guān)性研究采用等級相關(guān)分析。檢驗水準設(shè)定為α＝0.05。

　　2、結(jié)果

　　2.1、部分樣本的基因組DNA電泳情況

　　對本研究提取的部分樣本的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果如圖1所示。

　　2.2、各組研究對象腸道菌群水平比較

　　大腸癌組患者雙歧桿菌、乳酸桿菌水平均明顯低于大腸腺瘤組和對照組（P＜0.05），大腸桿菌、屎腸球菌、梭菌屬水平均明顯高于對照組（P＜0.05），糞腸球菌、擬桿菌屬、梭桿菌屬、脆弱擬桿菌、單形擬桿菌、多形擬桿菌、卵形擬桿菌、吉氏擬桿菌、普通擬桿菌、壞死梭桿菌、肉毒梭菌、艱難梭菌水平均明顯高于大腸腺瘤組和對照組（P＜0.05）；大腸腺瘤組雙歧桿菌、乳酸桿菌水平均明顯低于對照組（P＜0.05），大腸桿菌、糞腸球菌、梭桿菌屬、梭菌屬、脆弱擬桿菌、單形擬桿菌、多形擬桿菌、卵形擬桿菌、吉氏擬桿菌、普通擬桿菌、壞死梭桿菌、肉毒梭菌、艱難梭菌水平均明顯高于對照組（P＜0.05）（表1）。

　　2.3、腸道菌群與大腸癌發(fā)病的相關(guān)性分析

　　雙歧桿菌和乳酸桿菌與大腸癌發(fā)病呈負相關(guān)（P＜0.05），大腸桿菌、糞腸球菌、擬桿菌屬、梭桿菌屬、梭菌屬、脆弱擬桿菌、多形擬桿菌、普通擬桿菌、壞死梭桿菌、艱難梭菌與大腸癌發(fā)病呈正相關(guān)（P＜0.05）（表2）。

　　2.4、腸道菌群與大腸癌TNM分期的相關(guān)性分析

　　雙歧桿菌和乳酸桿菌與大腸癌TNM分期呈負相關(guān)（P＜0.05），大腸桿菌、擬桿菌屬、梭桿菌屬、脆弱擬桿菌與大腸癌TNM分期呈正相關(guān)（P＜0.05）（表3）。

　　3、討論

　　腸道內(nèi)細菌與宿主具有緊密的代謝關(guān)系，一旦腸道菌群失調(diào)，則會導致代謝紊亂，從而引發(fā)疾病。本研究通過應(yīng)用熒光定量PCR對大腸癌患者、大腸腺瘤患者及正常人群的糞便樣本的菌群進行了定性定量研究，準確測定了腸道細菌的變化。結(jié)果顯示，大腸癌組患者雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬水平均低于大腸腺瘤組和對照組，大腸桿菌、糞腸球菌、擬桿菌屬水平均高于大腸腺瘤組和對照組。這提示大腸癌患者腸道菌群出現(xiàn)微生態(tài)失調(diào)，與國內(nèi)外文獻研究一致[8-10]。Mira-Pascual等[11]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者、管狀腺瘤患者與健康人群菌群結(jié)構(gòu)不同，結(jié)直腸癌組織中存在較多的核酸桿菌和腸桿菌，這也提示結(jié)直腸癌的發(fā)病與菌群失調(diào)有關(guān)。付文政等[12]通過16SrRNA基因克隆文庫方法與454測序法比較大腸癌、大腸腺瘤患者及正常人群的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)三組研究對象菌群結(jié)構(gòu)存在差異，這也說明了腸道菌群結(jié)構(gòu)與大腸癌的關(guān)系。本研究中，菌群失調(diào)主要為有益菌的減少與有害菌的增多，表現(xiàn)為大腸癌患者糞便中厭氧菌與需氧菌的比值下降，即雙歧桿菌與大腸桿菌的比值下降。Rafter等[13]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者中腸道菌群出現(xiàn)微生態(tài)失調(diào)，雙歧桿菌/大腸桿菌的比值降低，結(jié)直腸癌患者術(shù)后出現(xiàn)雙歧桿菌與大腸桿菌比值倒置現(xiàn)象。本研究還發(fā)現(xiàn)，大腸癌組患者擬桿菌屬、梭桿菌屬、梭菌屬水平均高于對照組，這與Kostic等[14]研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬、梭桿菌屬、梭菌屬的致癌作用是通過其產(chǎn)生的致癌物質(zhì)或前致癌物質(zhì)而引起的[15-18]。

　　本研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌和乳酸桿菌與大腸癌的發(fā)病呈負相關(guān)，大腸桿菌、糞腸球菌、擬桿菌屬、梭桿菌屬等與大腸癌的發(fā)病呈正相關(guān)，更進一步證實了腸道菌群失調(diào)對大腸癌發(fā)病的影響。將菌群水平與大腸癌分期進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與大腸癌的發(fā)展具有相關(guān)性，與文獻研究一致[6，19，20]。

　　綜上所述，腸道菌群對大腸癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。但本研究樣本量較小，并未研究腸道菌群改變對大腸癌發(fā)生、發(fā)展的機制。因此，今后應(yīng)加大樣本量，進一步開展試驗研究以探索腸道菌群在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的機制。