微滴式數(shù)字PCR技術(shù)進展

　　1、技術(shù)核心原理

　　dPCR核心原理如下：將含有核酸分子的反應(yīng)體系處理為納升級的微滴，使每個微滴含或不含待檢靶分子，且每個微滴都作為一個獨立的PCR反應(yīng)器，經(jīng)PCR擴增后采用微滴閱讀儀逐個對微滴進行檢測，并以終點信號的有或無作為判斷標(biāo)準(zhǔn)（有熒光信號的微滴判讀為“1”，無熒光信號的微滴判讀為“0”）。最后，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的比例，利用分析軟件計算待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)，從而獲得最終結(jié)果。

　　域值循環(huán)數(shù)（cyclethreshold，Ct）是實時熒光定量PCR的重要概念，是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。對實時熒光定量PCR和dPCR的原理進行比較后可以發(fā)現(xiàn)，dPCR通過統(tǒng)計學(xué)原理直接給出靶序列的起始濃度，其結(jié)果不再依賴于Ct值[1]，可以避免實時熒光定量PCR在低拷貝靶分子、細微模板濃度差異中靈敏度和精確度相對較差的缺陷。

　　2、技術(shù)發(fā)展歷史

　　1999年，美國約翰?霍普金斯大學(xué)Ludwig中心的Kinzler和Vogelstein等[2]通過純手工操作將直腸癌患者糞便樣品基因組DNA稀釋并等分至384孔微量滴定板的各個孔中，然后通過PCR擴增，結(jié)果在超過100個孔中發(fā)現(xiàn)了基因組DNA，其中4個顯示出KAS基因突變。這一研究被認為是dPCR理念的開端之作。此后，研究人員開始從操作簡化及檢測便捷等方面對系統(tǒng)進行了優(yōu)化，并開發(fā)出了下列3種樣品分散模式：

　　（1）磁珠模式：主要包括以96孔板、384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體模式，以及利用“小珠、乳濁液、擴增、磁性”為主要操作流程的磁珠乳液擴增法（Beads，Emulsion，Amplification，Magnetics，BEAMing）。但上述兩種方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量方面均無法達到更加精細的要求。

　　（2）微滴模式：微滴模式是隨著納米制造技術(shù)（nanofabrication）、微流體技術(shù)（microfluidics），特別是二代測序技術(shù)發(fā)展起來的新模式，因此dPCR通常也被稱為“微滴式數(shù)字PCR（dropletdigatilPCR，ddPCR）”。

　　QuantaLife公司最早開發(fā)了ddPCR平臺。2011年，Bio-Rad公司收購了QuantaLife公司后更名為QX100?微滴式數(shù)字PCR儀[3]。2013年，升級為QX200。2012年，RainDance公司推出了Raindrop型號設(shè)備，這一設(shè)備可以將每個標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割為包含100萬至1000萬個皮升級別微滴的反應(yīng)乳液，從而獲得超高的微滴數(shù)目。

　　（3）芯片模式：1997年，Kalinina等[4]應(yīng)用納升級芯片進行了單克隆模板PCR擴增。2013年，LifeTechnologies公司推出了最新型號的QuantStudioTM3D數(shù)字PCR系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以使樣本均勻分配至2萬個完全單獨隔離的反應(yīng)孔中，能夠在盡可能簡化操作步驟的同時有效防止交叉污染，并有效避免了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問題[5]。

　　3、數(shù)字PCR的主要應(yīng)用

　　ddPCR具有諸多優(yōu)點[6]，近年關(guān)于以ddPCR為核心技術(shù)平臺的報道越來越多，本文將對其中幾個主要領(lǐng)域的應(yīng)用情況進行介紹。

　　3.1、突變位點檢測（mutationdetection）

　　隨著個體化治療理念的深入推進，突變基因檢測及突變位點癌細胞比例分析越來越受到個體化治療研究人員的重視和關(guān)注。研究表明，循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）是實體瘤治療效果和預(yù)后評估的重要監(jiān)測指標(biāo)之一，而高篩查能力、多分子檢測則是ctDNA應(yīng)用于臨床需要迫切解決的關(guān)鍵技術(shù)問題[7，8]。2013年，Hindson等[9]在NatureMethod發(fā)表文章，首次將ddPCR和實時熒光定量PCR在分析微小RNA（miRNA）表達水平的重復(fù)性進行了系統(tǒng)的統(tǒng)計學(xué)比較，證明了ddPCR技術(shù)可于不同情況下準(zhǔn)確、可重復(fù)性地定量檢測血漿和血清miRNAs，并為miRNAs及其他核酸用于循環(huán)生物標(biāo)志物的檢測提供了更多依據(jù)。

　　表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）的T790M突變被認為是EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosinekinasinhibitor，TKI）耐藥性產(chǎn)生的重要原因。吉非替尼（如易瑞沙）和厄洛替尼（如Tarceva）是TKI的典型代表。多項研究表明，ddPCR在EGFR相關(guān)突變檢測方面具有顯著優(yōu)勢[10-13]。Watanabe等[11]利用dPCR建立了一種具有超高檢測敏感性的EGFR突變檢測方法。Oxnard等[14]對9例接受厄洛替尼一線治療的非小細胞肺癌患者的血漿ctDNA進行了檢測，結(jié)果顯示，6例患者中檢出T790M突變；隨著治療周期的延長，突變濃度呈遞增趨勢，且在時間上較影像學(xué)確認的腫瘤惡化提前了16周。Zheng等[13]利用ddPCR開展了一項研究，證實非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥患者ctDNA中的EGFRT790M突變是一種不良結(jié)局的預(yù)測因子[13]。Isobe等[15]也證實，通過dPCR可以高效檢出肺腺癌患者癌組織、復(fù)發(fā)腫瘤組織以及血清游離DNA中的T790M突變，且復(fù)發(fā)灶T790M突變陽性患者原發(fā)灶突變頻率遠高于陰性患者。

　　Reid等[16]采用dPCR研究了惡性黑素瘤患者循環(huán)腫瘤細胞中BRAF基因V600E和V600K突變，結(jié)果表明，dPCR在靈敏度上高出實時熒光定量PCR200倍，檢測下限為0.0005%，表明dPCR高靈敏度檢測的強大優(yōu)勢。

　　伊馬替尼是一種BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑，可用于BCR-ABL陽性慢性粒細胞白血病的分子靶向治療。Mori等[17]研究發(fā)現(xiàn)，利用dPCR可以非常有效地預(yù)測伊馬替尼治療慢性粒細胞白血病的復(fù)發(fā)率。

　　3.2、基因表達分析

　　長期以來，如何對多等位基因拷貝數(shù)變異（multi-alleliccopynumbervariation，mCNV）進行準(zhǔn)確的遺傳學(xué)分析是困擾科研人員的難題之一。2015年，NatureGenetics報道了Hand-saker等[18]在這一領(lǐng)域的突破性進展，他們通過全基因組測序和ddPCR證實，人與人之間90%已觀察到的基因拷貝數(shù)差異均屬于mCNV。這一研究也從技術(shù)層面證實，ddPCR是一個非常有效的、可用于mCNV精確分析的技術(shù)平臺。

　　因樣本中含有大量PCR反應(yīng)的抑制物及無法找到合適的定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等原因，石蠟包埋組織、血液、糞便、食品、土壤等樣本的基因分析往往較困難。而dPCR可以完美解決上述問題[19-21]。Dingle等[22]系統(tǒng)比較了十二烷基硫酸鈉（sodiumdodcylsulfatesodiumsalt，SDS）、乙二胺四乙酸二鈉及肝素等常見PCR抑制物對ddPCR和實時熒光定量PCR的影響，結(jié)果顯示，ddPCR對SDS和肝素的耐受程度遠高于實時熒光定量PCR。姜羽等[23]、Witwer等[24]、Morisset等[25]研究均證實，ddPCR的靈敏度、重復(fù)性均優(yōu)于實時熒光定量PCR，具有實時熒光定量PCR無可比擬的優(yōu)勢。

　　Ferracin等[26]利用Bio-Rad公司的QX200TMddPCR系統(tǒng)，確定了多種癌癥患者的血漿和血清樣本中關(guān)鍵miRNA分子的絕對水平，他們通過比較癌癥患者和健康個體的數(shù)據(jù)證實miR-181a-5p有望成為乳腺癌的標(biāo)志物。

　　3.3、高通量測序結(jié)果的驗證與深入

　　高通量測序技術(shù)與ddPCR的聯(lián)合表現(xiàn)在下述兩方面：

　?。?）高通量測序技術(shù)中樣品制備流程和針對低含量核酸分子的成單分子測序?qū)dPCR系統(tǒng)革新具有重要的推動作用，這也是ddPCR技術(shù)不斷創(chuàng)新發(fā)展的重要基礎(chǔ)。

　?。?）數(shù)據(jù)量大、可拓展性強是高通量測序的主要特點，但這也造成后續(xù)結(jié)果分析困難、驗證難度大以及假陽性率高的缺陷。dPCR對二代測序結(jié)果的高性能驗證和分析可以為后續(xù)研究的準(zhǔn)確性奠定堅實基礎(chǔ)。Boettger等[27]首先通過高通量測序技術(shù)對人17號染色體的17q21.31區(qū)域進行了深入分析，之后采用dPCR對結(jié)果進行了大樣本量的驗證，結(jié)果顯示，dPCR的結(jié)果與高通量測序數(shù)據(jù)高度吻合，相關(guān)性＞99%。目前，dPCR與高通量測序、“陣列”聯(lián)用來進行CNV位點發(fā)現(xiàn)及確認已經(jīng)逐步成為一種標(biāo)準(zhǔn)化流程[3]。

　　3.4、病原學(xué)研究

　　ddPCR由于其絕對定量的特點在病毒的核酸檢測中也有很好的應(yīng)用前景。

　　“功能性治愈”是人類免疫缺陷病毒/艾滋病（HIV/AIDS）領(lǐng)域非常重要的臨床概念。2013年，Richman等報道了一項具有里程碑意義的研究成果：HIV感染患兒出生30小時后便開始接受組合式抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，29天后患兒HIV常規(guī)檢測結(jié)果呈陰性；隨后，應(yīng)用dPCR技術(shù)分別于出生后第24個月和第26個月對患兒血液中HIVRNA水平進行了反復(fù)檢測，結(jié)果僅能發(fā)現(xiàn)部分HIVRNA片段，未檢測到具有復(fù)制能力的HIV。在該項研究中，dPCR發(fā)揮了關(guān)鍵作用。目前，dPCR應(yīng)用于HIV相關(guān)核酸檢測的報道越來越多，重點應(yīng)用的仍然是其靈敏度和絕對定量兩方面[28-30]。

　　乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）慢性感染是導(dǎo)致原發(fā)性肝癌發(fā)生的重要原因。HBV共價閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）僅存在于被感染的肝細胞核內(nèi)，拷貝數(shù)極低，被認為是HBV感染慢性化及抗病毒治療停止后復(fù)發(fā)的最主要原因，也是目前HBV藥物研究的核心靶點之一。2015年，Mu等[31]采用基于絕對定量的dPCR對HBVcccDNA進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dPCR的檢測靈敏度可達單拷貝水平；基于dPCR的核酸檢測能夠?qū)BVcccDNA實現(xiàn)靈敏并精確的定量。此外，由于HBV表面抗原突變和低病毒載量等原因，原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中的HBV相關(guān)研究較為困難。Huang等[32]利用dPCR檢測了福爾馬林固定后石蠟包埋的肝癌組織標(biāo)本中的HBV特征，結(jié)果證實，dPCR能夠高效地檢出此類標(biāo)本中的HBVcccDNA，其線性范圍良好，具有很好的研究示范價值。

　　魏飛力等[33]評價了dPCR在HCVRNA定量檢測中的應(yīng)用價值，特別是其對低拷貝HCVRNA的定量檢測能力，結(jié)果提示，dPCR在線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度和檢測靈敏度方面均表現(xiàn)良好。目前臨床檢測中的HCVRNA定量試劑可以直接應(yīng)用于dPCR中，但其檢測結(jié)果，特別是極低檢測下限在臨床中的實際應(yīng)用價值尚需進一步研究。

　　3.5、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷

　　無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測（noninvasiveprenataltesting，NIPT）是一項非常具有應(yīng)用前景，但目前仍處于嘗試階段的產(chǎn)科診斷平臺。通常所謂的DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)是指通過高通量測序技術(shù)對母體外周血漿中的游離胎兒DNA（cell-freefetalDNA，cffDNA）進行測序，再通過測序結(jié)果的生物信息分析獲得胎兒遺傳信息的方法。一般認為，cffDNA是胎盤細胞凋亡的結(jié)果，最早可在妊娠5周時檢測到，其濃度隨著孕周增加而增加[34]。

　　由于cffDNA數(shù)量極少，能夠在多少拷貝的水平順利實現(xiàn)DNA或RNA分子穩(wěn)定檢出是影響其臨床應(yīng)用前景的關(guān)鍵性技術(shù)問題。傳統(tǒng)的基因組DNA大多采用商品化的核酸提取試劑盒進行。2013年，Holmberg等[35]比較了konniBiosystems公司的TruTip核酸提取技術(shù)和QIAGEN公司的CirculatingNucleicAcids試劑盒對于cffDNA提取的效果，結(jié)果顯示，TruTip試劑盒對片段化的cffDNA提取率較QIAGENò試劑盒提高了約87%，且定量PCR結(jié)果與ddPCR結(jié)果相關(guān)性良好。這一結(jié)果也為ddPCR用于產(chǎn)前診斷提供了成功的范例。目前，還有更多的類似研究和應(yīng)用正在開展[36]。

　　位于5q13的SMN1基因和SMN2基因是脊髓性肌萎縮（spinalmuscularatrophy，SMA）的致病基因，其中SMN2基因拷貝數(shù)的準(zhǔn)確檢測是SMA診斷的重要依據(jù)內(nèi)容。Zhong等[37]首先成功應(yīng)用dPCR技術(shù)對SMA樣本進行了SMN2基因拷貝數(shù)的檢測。Stabley等[38]也利用dPCR技術(shù)開展了針對SMN1和SMN2基因拷貝數(shù)的精確檢測，結(jié)果提示，該技術(shù)可以精確檢測0～3拷貝的SMN1基因和0～5拷貝的SMN2基因，且變異系數(shù)分別僅為1.6～3.7%和2.1～2.7%，其檢測下限和變異度均遠低于實時熒光定量PCR技術(shù)。Tsui等[39]應(yīng)用dPCR和相對突變劑量方法對血友病關(guān)鍵致病基因F8基因或F9基因雜合性突變攜帶孕婦進行了研究，結(jié)果提示，dPCR在以血友病為代表的X-連鎖遺傳性疾病檢測中具有非常好的檢測性能。此外，dPCR在鐮狀細胞性貧血和22q11.2微缺失綜合征等疾病診斷方面的研究尚在不斷開展和深入過程中。

　　dPCR作為一項新的技術(shù)，還有許多問題需要進一步探討，包括技術(shù)本身以及應(yīng)用方面。相信隨著應(yīng)用的深入，ddPCR技術(shù)一定會以更好的性能在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更多、更好的作用。