基于實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法的病毒核酸檢測是目前新冠病毒感染確診的重要手段。然而，一直有媒體及專家反映，新冠病毒核酸檢測的陽性率低，有的病例重復(fù)檢測多次陰性后又出現(xiàn)陽性結(jié)果，咽拭子標(biāo)本多次檢測陰性、但最后在呼吸道灌洗液標(biāo)本中檢測出陽性結(jié)果等問題。

為明確這些問題的原因，近日，解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心王成彬主任在《中華醫(yī)學(xué)雜志》在線發(fā)表文章《核酸檢測用于確診新型冠狀病毒肺炎陽性率低的原因分析》，從患者病程、標(biāo)本采集、標(biāo)本運(yùn)輸與保存、標(biāo)本處理、核酸提取與擴(kuò)增、病毒核酸變異等方面對影響核酸檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的原因進(jìn)行分析。

目前，無論是臨床實(shí)驗(yàn)室還是疾病預(yù)防控制中心（CDC）實(shí)驗(yàn)室，普遍應(yīng)用的是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行病毒核酸檢測。簡單來說，該方法是將標(biāo)本中的特定核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，理論上每一次擴(kuò)增后的核酸數(shù)量都是成倍增加，經(jīng)過40次以上擴(kuò)增后，其核酸數(shù)量可達(dá)到足夠通過熒光等常規(guī)方法進(jìn)行檢測。

我們應(yīng)在重視和肯定核酸檢測在病毒感染診斷中重要價(jià)值的同時(shí)，也要客觀考慮由于其方法學(xué)特點(diǎn)、疾病發(fā)展過程、標(biāo)本采集、標(biāo)本保存與運(yùn)輸、核酸提取、擴(kuò)增體系、人員操作等多方面因素都可能造成最后檢測結(jié)果的假陰性或假陽性。那么，上述因素具體如何影響最終檢測結(jié)果呢？

病毒存在量是否“達(dá)線”

大部分新冠肺炎患者的發(fā)病都會(huì)經(jīng)歷一個(gè)從感染后無癥狀到輕度癥狀出現(xiàn)，直至痊愈；少部分患者會(huì)發(fā)展到嚴(yán)重癥狀出現(xiàn)的過程。

不同病程、不同病情患者的機(jī)體中病毒存在量可能不同，導(dǎo)致已有病毒感染，但由于在相關(guān)部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以至于用現(xiàn)有方法檢測不到。

因此，對臨床高度疑似新冠肺炎患者，應(yīng)該連續(xù)采集標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測（這可能是臨床患者多次檢測陰性，陽性結(jié)果出現(xiàn)晚的主要原因之一）。其實(shí)，任何病原學(xué)檢測都不能只根據(jù)1次陰性結(jié)果而做出排除性診斷，更不能根據(jù)核酸檢測陰性而漏診臨床高度疑似的新冠肺炎患者，尤其在高發(fā)地區(qū)和大面積流行期間。

標(biāo)本采集運(yùn)輸是否規(guī)范

1.標(biāo)本采集部位很多專家從實(shí)踐工作中總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，鼻咽拭子標(biāo)本核酸檢測陽性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液標(biāo)本陽性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的標(biāo)本（這也是近期被廣泛評論的某患者咽拭子標(biāo)本3次核酸檢測陰性，收住院后在搶救過程中采集肺泡灌洗液標(biāo)本核酸檢測陽性的原因）。但是，下呼吸道的痰、肺泡灌洗液標(biāo)本采集難度太大、易引起患者噴濺導(dǎo)致采集操者感染風(fēng)險(xiǎn)增大。因此，一般情況下，不建議使用（氣管切開、呼吸機(jī)搶救患者可用）。

《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版修正版）》已將標(biāo)本采集“咽拭子”更新為“鼻咽拭子”。為提高檢測陽性率，建議采集同一患者多部位標(biāo)本，合并進(jìn)行檢測。例如，用口咽拭子、鼻咽拭子同時(shí)采集標(biāo)本，然后放到同一采集管中送檢。對于有消化道癥狀的疑似患者，可同時(shí)采集糞便或肛拭子進(jìn)行檢測。

2.標(biāo)本采集方法采樣的準(zhǔn)確性存在操作者個(gè)人的依賴性。如果標(biāo)本采集者操作不規(guī)范，也會(huì)導(dǎo)致采樣誤差。如果平時(shí)醫(yī)護(hù)人員咽拭子取樣不多，刮取標(biāo)本時(shí)患者的反應(yīng)又比較大，往往導(dǎo)致刮取標(biāo)本的位置不對，或力度和時(shí)間不夠，沒有刮取到帶病毒的標(biāo)本或刮取到的帶病毒標(biāo)本量少，最后檢測結(jié)果陰性率必然增加。

3.標(biāo)本運(yùn)輸及保存新冠病毒很容易被來自試劑、耗材等外源性或細(xì)胞破壞后所釋放的內(nèi)源性RNA酶降解，而影響最后的檢測效率。

嚴(yán)格來講，標(biāo)本采集后應(yīng)及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室（疾控中心、醫(yī)院檢驗(yàn)科、第三方實(shí)驗(yàn)室），盡快完成檢測。

標(biāo)本在常溫下放置時(shí)間過長也可能造成最后檢測結(jié)果假陰性。

雖然，我們可以使用防病毒核酸降解的標(biāo)本采集管，但目前此類產(chǎn)品數(shù)量少、成本高、實(shí)際應(yīng)用效果尚需要進(jìn)一步評價(jià)。因此，我們建議標(biāo)本采集后應(yīng)及時(shí)送檢，及時(shí)檢測（4小時(shí)）。

檢測環(huán)節(jié)是否標(biāo)準(zhǔn)化

1.核酸提取方式前面已述及新冠病毒的核酸檢測需要對所采集標(biāo)本的核酸進(jìn)行提取。

目前，實(shí)驗(yàn)室較常用的提取標(biāo)本核酸的方法為手工提取和核酸全自動(dòng)提取儀提取。

手工法實(shí)驗(yàn)過程由于人員等因素難以做到標(biāo)準(zhǔn)化；全自動(dòng)核酸提取儀法在整個(gè)過程中需使用配套的核酸提取儀及相應(yīng)的試劑，整個(gè)操作易于標(biāo)準(zhǔn)化。

相比于手工法，核酸全自動(dòng)提取儀可避免一些手工操作容易出現(xiàn)的差錯(cuò)，對于檢測結(jié)果影響較小。

而不同提取試劑和手工提取流程的掌控對最后提取到的核酸數(shù)量和質(zhì)量可能存在差別。與此同時(shí)，從標(biāo)本中所提取出的核酸數(shù)量和質(zhì)量對于檢測方法中下一個(gè)步驟的核酸擴(kuò)增至關(guān)重要，從而直接影響最后的檢測結(jié)果。

2.核酸擴(kuò)增環(huán)節(jié)由于不同廠家的試劑研發(fā)是根據(jù)新冠病毒核酸OFR1ab、N、E等基因的特異性序列設(shè)計(jì)的擴(kuò)增探針（不同廠家的擴(kuò)增試劑可分為1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)靶標(biāo)基因位點(diǎn)檢測試劑），而包含有不同靶標(biāo)基因位點(diǎn)的試劑檢測敏感度、特異度不同，試劑中酶、金屬離子等成分與質(zhì)量的差異等，也都可能影響擴(kuò)增效率和最后的檢測結(jié)果。

3.試劑研發(fā)與應(yīng)用由于導(dǎo)致本次疫情的是一種新型病毒，加之疫情的突發(fā)性，試劑生產(chǎn)商只能根據(jù)有限公開的病毒核酸研究數(shù)據(jù)來開展試劑研發(fā)。

國家相關(guān)部門最早推薦了一些廠家的檢測產(chǎn)品，后來又審批了多個(gè)廠家檢測試劑的注冊申請。試劑生產(chǎn)廠家不同，核酸檢測試劑盒的質(zhì)量參差不齊，也會(huì)影響檢測結(jié)果。

目前，開展新冠病毒檢測試劑研發(fā)生產(chǎn)的廠家已超過百家。正常情況下，一個(gè)臨床檢測試劑產(chǎn)品從研發(fā)到應(yīng)用需要通過一系列的臨床驗(yàn)證與評估，但由于本次疫情的特殊性，時(shí)間緊迫，因此，研發(fā)試劑來不及完成常規(guī)流程，特別是無法得到一定數(shù)量的臨床患者標(biāo)本的驗(yàn)證。

有些廠家只能用新冠病毒目標(biāo)RNA序列通過噬菌體蛋白外殼包裹等方式模擬真實(shí)標(biāo)本中的病毒進(jìn)行驗(yàn)證。因此，對于臨床某些高度疑似病例，或檢測結(jié)果難以確定病例，建議用2種以上試劑進(jìn)行檢測、驗(yàn)證。

近期，中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)組織了相關(guān)方面專家對新冠病毒核酸檢測工作進(jìn)行了探討，并出臺了核酸檢測相關(guān)專家共識，同時(shí)一些新的基因檢測平臺也在不斷研發(fā)。隨著基因測序、數(shù)字PCR、RTPCR毛細(xì)管電泳等技術(shù)的應(yīng)用，新冠病毒核酸檢測中的問題一定會(huì)得到持續(xù)改進(jìn)。