肼或烷基肼/苯基肼常用作制藥中的原料合成中間體或API，例如氨基脲、異煙肼、呋喃西林、鹽酸阿齊利特、硫酸阿米卡星等。肼類化合物有巨毒，能夠?qū)Ω?、腎、血液等系統(tǒng)帶來很大的副作用。有數(shù)據(jù)資料顯示，肼是已知的基因毒性雜質(zhì)，具有潛在的致癌性，肼類化合物主要是通過代謝活化而生成碳正離子和碳氧自由基等活性較強(qiáng)的中間體，可與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)或者導(dǎo)致DNA其他病變。

基因毒性雜質(zhì)或者潛在基因毒性雜質(zhì)嚴(yán)重威脅人類健康，關(guān)于如何嚴(yán)格控制藥物中這類雜質(zhì)的限度或要求在我們之前的文章已有闡述，在此不做詳述。歐洲藥典和美國(guó)藥典中列出了部分以肼作為原料的藥物中，肼的允許限值(根據(jù)治療期及服用劑量來計(jì)算)范圍是從1ppm到1000ppm，因此，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度要求有一定差異。由于此類雜質(zhì)，如甲基肼、二甲基肼等具有強(qiáng)活潑性、揮發(fā)性、分子量小等一些特殊的化學(xué)性質(zhì)，故檢測(cè)方法在靈敏度、選擇性、待測(cè)物穩(wěn)定性、基質(zhì)復(fù)雜性等方面呈現(xiàn)特殊要求，因此在分析方法的開發(fā)和選擇上具有與其他藥物雜質(zhì)檢測(cè)不同的特點(diǎn)。除此之外，肼類化合物容易與色譜柱上的硅氧基相互作用，導(dǎo)致峰形嚴(yán)重拖尾，是分析方法建立過程中的難點(diǎn)。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、高靈敏的檢測(cè)方法來監(jiān)測(cè)藥物生產(chǎn)過程中肼類基毒雜質(zhì)的殘留量顯得愈加緊迫。根據(jù)參考各國(guó)藥典及文獻(xiàn)，總結(jié)了部分含有肼類基毒雜質(zhì)藥物的種類，詳見表1。

常用的檢測(cè)方法:

直接進(jìn)樣法：

相關(guān)資料顯示，對(duì)于揮發(fā)性較強(qiáng)的烷基肼，一般經(jīng)常采用GC-FID法進(jìn)行直接測(cè)定；對(duì)于不含碳原子的肼類化合物，可以采用氮磷檢測(cè)器(NPD)和質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定；而對(duì)于在色譜柱上保留較強(qiáng)的肼類化合物，可以采用高效液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)進(jìn)行測(cè)定。由于肼類化合物是一種質(zhì)子堿，能夠在酸性溶液中離子化，因此也可采用離子色譜法測(cè)定這類易電離的化合物，如離子交換色譜-電化學(xué)檢測(cè)器(IEC-CD)、離子交換色譜-安培檢測(cè)器(IEC-AD)，但是常規(guī)的離子色譜直接測(cè)定藥物中肼類基毒雜質(zhì)的殘留時(shí)，經(jīng)常會(huì)存在檢測(cè)靈敏度較低的問題，因此目前不作為常用方法來考慮。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，利用氮化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(HILIC-CLND)測(cè)定烷基肼類基毒雜質(zhì)時(shí)，檢測(cè)限及靈敏度亦可以達(dá)到要求。

衍生化法：

對(duì)于甲基肼、二甲基肼等這類具有揮發(fā)性、分子量小、化學(xué)性質(zhì)活潑或無助色基團(tuán)的化合物，衍生化法則是測(cè)定該類化合物的主要方法之一。而苯甲醛為最常用的衍生化試劑，衍生化后采用HPLC-UV、GC、LC-MS等方法測(cè)定衍生物，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、高效且具有很高的靈敏度。USP中就采用了苯甲醛衍生化后，HPLC-UV直接進(jìn)樣檢測(cè)鹽酸肼苯噠嗪中肼的殘留量。除此之外，還可以用丙酮或者氘代丙酮作為衍生化試劑，衍生化后采用HS-GC-EI-MS進(jìn)行殘留量測(cè)定。

塞來昔布：

塞來昔布(化合物1，圖2)，是一個(gè)磺胺類非甾體類抗炎藥(NSAID)，是美國(guó)Searle公司推出的第一個(gè)特異性2型環(huán)氧化酶抑制劑(COX-2)，可用于治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性疼痛、痛經(jīng)等月經(jīng)癥狀等。通過抑制環(huán)氧化酶阻止炎性前列腺素類物質(zhì)的產(chǎn)生，可顯著減少胃腸道的不良反應(yīng)。無論對(duì)于急性創(chuàng)傷外傷導(dǎo)致的急性疼痛，還是外科手術(shù)后的止痛，都是理想的鎮(zhèn)痛藥物。在塞來昔布的合成工藝(圖2)中，一般以對(duì)甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯為原料經(jīng)Claisen縮合反應(yīng)制得中間體，然后與對(duì)苯磺酰胺基苯肼鹽酸鹽反應(yīng)制得塞來昔布，因此塞來昔布原料藥中可能存在對(duì)磺酰胺基苯肼鹽酸鹽(SHH，化合物5，圖2)及(對(duì)甲基苯乙酮)對(duì)磺胺苯肼鹽酸鹽(MAP，可能為反應(yīng)過程中的副產(chǎn)物)，這兩種化合物結(jié)構(gòu)與已知基因毒雜質(zhì)有類似性，須嚴(yán)格控制其毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)。該藥物一般通過口服攝入，最大每日劑量為200mg，根據(jù)ICH發(fā)布基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5μg/d計(jì)算，對(duì)應(yīng)的兩種基因毒性雜質(zhì)的總TTC水平為7.5ppm。

因此，利用LC-MS/MS的方法同時(shí)測(cè)定兩種雜質(zhì)，以醋酸銨-乙腈作為流動(dòng)相，根據(jù)ICH指南要求，對(duì)方法進(jìn)行了檢測(cè)限(LOD)、定量限(LOQ)、線性、精密度、準(zhǔn)確性等相關(guān)驗(yàn)證，兩種雜質(zhì)在0.06~7.5ppm的范圍內(nèi)均成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.9998，兩個(gè)雜質(zhì)的LOD和LOQ分別能夠達(dá)到0.02ppm及0.06ppm，回收率在95%~104%之間，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，適合在痕量水平下對(duì)塞來昔布進(jìn)行質(zhì)量控制。

地拉羅司：

地拉羅司(化合物5，圖3)是一種新型鐵螯合劑，通過與體內(nèi)的鐵離子結(jié)合，有效的提高鐵的排泄，降低體內(nèi)鐵的含量，可減少由鐵超載引起的組織損傷及多個(gè)臟器的功能損害，由FDA批準(zhǔn)上市。地拉羅司的合成是以水楊酸為原料，經(jīng)氯化亞砜氯化得到水楊酰氯，水楊酰氯與水楊酸酰胺在高溫減壓蒸餾的條件下得到中間體8(圖3)，最后再與對(duì)羧基苯肼環(huán)合制備而得到成品。事實(shí)上，所用的原料對(duì)羧基苯肼(化合物10，圖3)已經(jīng)被證實(shí)具有潛在的遺傳毒性和致癌性，因此，依據(jù)EMA和FDA相應(yīng)的指導(dǎo)原則，有必要對(duì)地拉羅司中的對(duì)羧基苯肼進(jìn)行定量分析。

因此，利用HPLC-UV的方法直接進(jìn)樣檢測(cè)，以高氯酸-乙腈為流動(dòng)相(用0.1%的三乙胺溶液調(diào)節(jié)pH)，在該方法下對(duì)羧基苯肼的LOD和LOQ分別為0.16μg/mL和0.5μg/mL，在0.5~1.5μg/mL的濃度范圍內(nèi)均成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.999，收率在102%之間。該方法快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，省去了衍生化復(fù)雜的操作步驟，且符合檢測(cè)的要求。

總結(jié)：

肼類化合物作為潛在的基因毒性雜質(zhì)，大多是從起始物料或者中間體中直接帶入或者從合成副反應(yīng)中引入，因此在生產(chǎn)過程中要對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的控制，建立合適的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和已驗(yàn)證的分析方法對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行痕量殘留檢測(cè)是非常重要的。若藥物活性成分生產(chǎn)的最后一步合成步驟用到了肼類物質(zhì)，應(yīng)將其納入風(fēng)險(xiǎn)分析。

但在實(shí)際生產(chǎn)中，需要對(duì)合成路線進(jìn)行篩選，應(yīng)盡量避免使用到GTI/PGI，所以盡可能開發(fā)可以控制這些缺陷的替代合成路線。如果在技術(shù)上不可行，這就要求我們對(duì)整個(gè)可能會(huì)產(chǎn)生基毒雜質(zhì)的環(huán)節(jié)進(jìn)行詳細(xì)的控制，必須根據(jù)TTC概念確定安全限度，并且建立合理的分析方法去檢測(cè)和量化這些基毒雜質(zhì)的殘留量，使其符合安全的需要。

目前，基因毒性雜質(zhì)控制是藥品質(zhì)量控制的核心內(nèi)容之一，而合成過程中基因毒雜質(zhì)的鑒別與控制由于它們的演變性和不確定性，將會(huì)帶來非常大的挑戰(zhàn)。因此必須從制備工藝和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)分析入手，評(píng)估、預(yù)測(cè)產(chǎn)品中可能存在的副產(chǎn)物、中間體、降解物以及試劑、催化劑等，這才是保證藥品安全的關(guān)鍵要素，也是確保藥品研發(fā)中風(fēng)險(xiǎn)控制意識(shí)的重要體現(xiàn)。