QbD的起源

　　QbD在生物制藥行業(yè)的作用日趨突出，該行業(yè)要遵循美國(guó)FDA頒發(fā)的創(chuàng)新醫(yī)藥制造業(yè)PATA框架和質(zhì)量保證文件。其所包含的ICH指導(dǎo)原則中的相關(guān)概念得到了全球的普遍認(rèn)可，ICH Q8 藥物開發(fā)，ICH Q9質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理，ICH Q10藥物質(zhì)量體系，ICH Q11原料藥開發(fā)和生產(chǎn)。在過(guò)去的十年里，生物技術(shù)行業(yè)和其監(jiān)管機(jī)構(gòu)尤其是美國(guó)FDA實(shí)施了必要的基礎(chǔ)工作來(lái)為QbD的實(shí)施鋪平道路，并解決了多種包括可能影響其成功實(shí)施的問(wèn)題。雖然到目前為止僅有一個(gè)生物藥用QbD的方式通過(guò)了申請(qǐng)，但其相關(guān)的工具和方法已經(jīng)成為全球化制藥公司的工作過(guò)程中的固有形式。

　　本文將列舉生物仿制藥GCSF進(jìn)行逐步純化工藝開發(fā)的例子對(duì)QbD進(jìn)行詮釋，并通過(guò)案例分析幫助那些在想在生物制品工藝開發(fā)和商業(yè)化生產(chǎn)時(shí)實(shí)施QbD的人們。

　　QbD是什么

　　在ICH Q8中對(duì)QbD進(jìn)行了定義，即在可靠的科學(xué)和質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理的基礎(chǔ)上，預(yù)先定義好目標(biāo)并強(qiáng)調(diào)對(duì)產(chǎn)品與工藝的理解以及工藝控制的一個(gè)系統(tǒng)的研發(fā)方法。傳統(tǒng)方法是廠家確定目標(biāo)產(chǎn)品定義工藝，然后針對(duì)產(chǎn)品的期望結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。如果產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到預(yù)期，廠家就會(huì)固定工藝，然后在很小的工藝操作范圍內(nèi)進(jìn)行生產(chǎn)。這就是所謂的“如果操作的過(guò)程是一致的，那么生產(chǎn)的產(chǎn)品也應(yīng)該是一致的”，這種方法已經(jīng)被生物制藥公司應(yīng)用了30多年了。而QbD方法是針對(duì)生物藥的開發(fā)與生產(chǎn)，與上面描述的傳統(tǒng)方法有著顯著的差異，結(jié)果說(shuō)明見圖1。關(guān)鍵步驟：（1）確認(rèn)對(duì)安全性和有效性有顯著影響的產(chǎn)品屬性（例如QTPP和CQA）；（2）通過(guò)工藝設(shè)計(jì)來(lái)實(shí)現(xiàn)這些屬性；（3）通過(guò)穩(wěn)健的控制策略來(lái)保證工藝性能的穩(wěn)定；（4）對(duì)工藝進(jìn)行驗(yàn)證和文件化來(lái)證明控制策略的有效性；（5）繼續(xù)在產(chǎn)品的生命周期內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，來(lái)保證穩(wěn)健的工藝性能。此外，通過(guò)知識(shí)管理、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管理、原料管理、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以及過(guò)程分析技術(shù)來(lái)為QbD的實(shí)施提供基礎(chǔ)。

　　QbD應(yīng)用于工藝開發(fā)

　　i. 確認(rèn)CQA

　　將CQA定義為“物理、化學(xué)、生物或微生物學(xué)屬性，或是對(duì)特征進(jìn)行適當(dāng)?shù)南薅?、范圍或分布進(jìn)行描述來(lái)保證目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量”。由于工藝開發(fā)應(yīng)當(dāng)關(guān)注于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)品CQA定義的質(zhì)量達(dá)到想要的一致性，因此在工藝開發(fā)前就需要確認(rèn)產(chǎn)品的CQA。在產(chǎn)品開發(fā)的所有關(guān)鍵階段都需要對(duì)CQA名單進(jìn)行回顧，以便保證非臨床、穩(wěn)定性和臨床研究的數(shù)據(jù)更加可靠。當(dāng)這些發(fā)生時(shí)，需要進(jìn)行工藝能力評(píng)估。

　　ii. 定義產(chǎn)品設(shè)計(jì)空間

　　“設(shè)計(jì)空間”這個(gè)概念作為一個(gè)工具已經(jīng)普遍的應(yīng)用于生物藥QbD的實(shí)施。ICH Q8將其定義為：輸入變量（比如物料屬性）的多維組合和交互作用以及已被證明的能夠?yàn)楫a(chǎn)品質(zhì)量提供保證的工藝參數(shù)。只要是在設(shè)計(jì)空間內(nèi)進(jìn)行的操作，不認(rèn)為是變更。而在設(shè)計(jì)空間外的操作才被認(rèn)為是變更，并且一般情況下要通過(guò)監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)工藝變更后才能使用。設(shè)計(jì)空間是由申請(qǐng)人提議的，并且要受監(jiān)管的評(píng)估與批準(zhǔn)。

　　一旦確認(rèn)CQA，下一步就要定義CQA變量的可接受水平。設(shè)計(jì)空間窗口的大小直接影響工藝開發(fā)，如果產(chǎn)品設(shè)計(jì)空間較?。?biāo)準(zhǔn)要求比較嚴(yán)），那么工藝參數(shù)同樣要控制在較小的操作范圍內(nèi)來(lái)保證產(chǎn)品能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。相反，如果產(chǎn)品設(shè)計(jì)空間較大（標(biāo)準(zhǔn)要求寬松），那么工藝就相對(duì)靈活一些。

　　iii. 定義工藝設(shè)計(jì)空間

　　在定義CQA和可接受的變量范圍后，應(yīng)進(jìn)行工藝特征研究將CQA和工藝每一步的工藝變量、原料屬性和進(jìn)料屬性相聯(lián)系。在QbD范例中通過(guò)DoE方法來(lái)進(jìn)行研究的，這樣不僅可以明白變量的主要影響，而且也可以弄明白它們間的交互作用。研究結(jié)果在復(fù)合、多維和經(jīng)驗(yàn)的模型形式中是比較典型的，而該模型能夠?qū)⒉煌腃QA和多種因子相聯(lián)系。

　　iv. 定義控制策略

　　控制策略定義為：源于對(duì)現(xiàn)行產(chǎn)品和工藝的理解，能夠保證工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量的有計(jì)劃的一些列控制活動(dòng)。在QbD中，控制策略要圍繞著規(guī)定工藝能力和產(chǎn)品CQA。上述的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍艿湫偷挠糜诙x有效的工藝參數(shù)的可接受范圍。然后通過(guò)控制策略來(lái)保證工藝能夠按既定軌道進(jìn)行，并且產(chǎn)品的質(zhì)量能夠始終如一的滿足預(yù)定義的質(zhì)量要求。

　　v. 描述產(chǎn)品特征

　　一旦定義并實(shí)施了控制策略，就要進(jìn)行適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控來(lái)證明設(shè)計(jì)的工藝具有穩(wěn)定的生產(chǎn)出能達(dá)標(biāo)產(chǎn)品的能力。這一活動(dòng)也是對(duì)QbD能用于工藝開發(fā)的驗(yàn)證。

　　實(shí)施QbD的動(dòng)力

　　實(shí)施QbD具有如下幾個(gè)動(dòng)力：

　　（1）QbD中的操作范圍是比較寬泛的，這來(lái)源于經(jīng)確認(rèn)的影響CQA的關(guān)鍵工藝參數(shù)的鑒別。這與傳統(tǒng)的制造業(yè)形成鮮明對(duì)比，由于工藝開發(fā)者并不知道哪個(gè)工藝參數(shù)是關(guān)鍵的，傳統(tǒng)制造業(yè)的所有工序的操作范圍是比較窄的。（2）在QbD中產(chǎn)品質(zhì)量參數(shù)范圍是比較寬泛的，這是因?yàn)楫a(chǎn)品的質(zhì)量是基于對(duì)工藝和產(chǎn)品的理解而制定的。這促使我們的操作具有一定的靈活性，特別是對(duì)非CQA而言，而這種靈活性主要體現(xiàn)在比較寬的操作范圍。

　?。?）更穩(wěn)健的工藝。以動(dòng)態(tài)控制策略為基礎(chǔ)的過(guò)程分析技術(shù)能開發(fā)出更穩(wěn)健的工藝，該工藝能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量是始終如一的。

　?。?）顯著降低失敗風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樵赒bD中我們是按照PAT范例進(jìn)行實(shí)時(shí)或接近實(shí)時(shí)的產(chǎn)品質(zhì)量測(cè)試的。

　?。?）工藝變更負(fù)擔(dān)小。QbD的監(jiān)管機(jī)構(gòu)備案文件是知識(shí)的基礎(chǔ)，它關(guān)注于闡述工藝和CQA以及CQA和產(chǎn)品的安全性和有效性的關(guān)系。而傳統(tǒng)的備案文件要羅列出所有參數(shù)和屬性，包括CPP和非CPP，CQA和非CQA。因此，當(dāng)需要做工藝變更時(shí)，我們的備案文件也需要做變更。這給生物技術(shù)企業(yè)帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)，這也是為什么企業(yè)都傾向于保守并且拒絕接受新的技術(shù)和實(shí)踐。

　?。?）更少的生產(chǎn)偏差。有效的生產(chǎn)能將QbD貫穿于產(chǎn)品的整個(gè)生命周期中，這使得操作范圍和質(zhì)量參數(shù)比較寬泛，從而減少生產(chǎn)偏差。由于生產(chǎn)商已經(jīng)有數(shù)據(jù)對(duì)偏差對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響進(jìn)行了闡述，因此當(dāng)出現(xiàn)任何與前面所描述的數(shù)據(jù)不一致時(shí)我們可以相對(duì)迅速的將其解決。

　　（7）得到更理想的工藝。在試驗(yàn)過(guò)程中廣泛的使用DoE進(jìn)行優(yōu)化，并考慮生產(chǎn)力和經(jīng)濟(jì)學(xué)，這能夠開發(fā)出比較理想的工藝。通過(guò)DoE選擇的條件是全局最優(yōu)條件，而不僅僅是局部的最優(yōu)條件。因此工藝是比較穩(wěn)健的，并且可以避免不必要的昂貴的返工。

　　下面本文將結(jié)合下面給出的案例淺談一下怎樣才能實(shí)現(xiàn)以上描述的益處。

　　通過(guò)QbD進(jìn)行一個(gè)仿制藥產(chǎn)品的下游工藝開發(fā)的案例研究

　　在本章節(jié)中將會(huì)提供一個(gè)案例來(lái)說(shuō)明QbD是如何在生物仿制藥（GCSF）下游工藝開發(fā)中實(shí)施的。本章節(jié)的案例來(lái)自于對(duì)先前已經(jīng)發(fā)表過(guò)的研究的總結(jié)。

　　i. 確認(rèn)CQA

　　為了確定GCSF的CQA，我們進(jìn)行了全面的文獻(xiàn)檢索、GCSF商業(yè)生產(chǎn)商的調(diào)查以及現(xiàn)存的GCSF的相關(guān)著作，結(jié)果如表1。表1中，CQA能夠分為幾類：產(chǎn)品相關(guān)變體雜質(zhì)、宿主細(xì)胞雜質(zhì)、設(shè)施相關(guān)屬性和與生物治療藥建立同一性和效力相關(guān)的東西。

　　產(chǎn)品相關(guān)的變體和雜質(zhì)是一類重要的值得進(jìn)一步討論的分類，對(duì)于GCSF而言需要進(jìn)一步考慮的關(guān)鍵屬性包括產(chǎn)品的氧化、還原、聚體和fMet的形式。有人認(rèn)為蛋氨酸的氧化能導(dǎo)致蛋白的物化性質(zhì)改變，從而使蛋白失去生物活性。同樣的，GCSF的還原形式同樣被認(rèn)為是對(duì)其生物活性有影響的。此外異源蛋白的高水平表達(dá)已經(jīng)被證明了其能夠?qū)е翯CSF N甲酰蛋氨酸變體形式的甲?；鶊F(tuán)部分保留。但是與天然GCSF蛋白相比，我們認(rèn)為變體是有相同的生物活性的。它的存在可能會(huì)引起病人的免疫原性反應(yīng)，因此需要監(jiān)測(cè)和控制其含量。最后，聚體被普遍的認(rèn)為能夠引起病人的免疫原性反應(yīng)，因此將其作為生物治療藥的CQA考量。正如表1描述的那樣，首先應(yīng)該關(guān)注的是能夠被下游工藝影響的CQA。

　　本案例中關(guān)注的是生物仿制藥產(chǎn)品的下游工藝開發(fā)，首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索來(lái)建立CQA。如果是進(jìn)行開發(fā)創(chuàng)新要的話，過(guò)程將會(huì)有所不同。在本案例的基礎(chǔ)上，應(yīng)當(dāng)通過(guò)其它方法進(jìn)行重要的補(bǔ)充。經(jīng)常的，該策略應(yīng)當(dāng)涉及以下幾方面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：分子（熱點(diǎn)和分子工程）設(shè)計(jì)；產(chǎn)品和其它平臺(tái)產(chǎn)品通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行非臨床研究；產(chǎn)品和其它平臺(tái)產(chǎn)品的臨床研究；發(fā)表的文獻(xiàn)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的結(jié)果應(yīng)該是危急程度的連續(xù)統(tǒng)一體，產(chǎn)品質(zhì)量屬性應(yīng)該羅列其中。對(duì)安全性和有效性有影響的（比如聚體種類）應(yīng)當(dāng)排在高危急程度位置，對(duì)安全性和有效性沒有影響的（例如C末端賴氨酸雜質(zhì)）排在低危急程度位置。

　　ii. 定義產(chǎn)品設(shè)計(jì)空間

　　表1羅列了本案例選擇的產(chǎn)品質(zhì)量參數(shù)，這主要是基于GCSF專著提供的相關(guān)信息。這些數(shù)據(jù)將會(huì)進(jìn)一步用于下游工藝的設(shè)計(jì)。

　　iii. 定義工藝設(shè)計(jì)空間

　　本步驟是本案例中關(guān)注的重點(diǎn)，涉及了多個(gè)步驟方法的應(yīng)用，包括：復(fù)性工藝的優(yōu)化；建立高通量工藝開發(fā)平臺(tái)應(yīng)用于層析工藝開發(fā)；多種層析模式的評(píng)估；工藝整合。本步驟的關(guān)鍵點(diǎn)是為每個(gè)工序建立一個(gè)合適的縮小的規(guī)模，該規(guī)模在使用前必須保證是有效的，以便保證在研究過(guò)程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能適用于商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

　　我們將使用基于QbD的DoE方法進(jìn)行復(fù)性工藝優(yōu)化。首先我們通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)分析來(lái)確定需要進(jìn)行試驗(yàn)考察的工藝參數(shù)（圖2A）。接下來(lái)，我們通過(guò)部分因子初篩試驗(yàn)設(shè)計(jì)（圖2B）來(lái)考量溫度；復(fù)性pH；包涵體、尿素、半胱氨酸以及DTT的濃度。基于以上研究結(jié)果，我們將使用全因子DoE試驗(yàn)對(duì)pH、尿素濃度以及DTT濃度做進(jìn)一步考量，來(lái)闡述其對(duì)每一步得率和產(chǎn)品質(zhì)量的影響，以及他們之間的交互作用（圖2C）。結(jié)果本工藝的復(fù)性率能達(dá)到77 %，這遠(yuǎn)高于商業(yè)化的GCSF的復(fù)性率（40-60 %）。最終將產(chǎn)品的設(shè)計(jì)空間設(shè)定為可接受的范圍：得率大于70 %；蛋白濃度大于0.18 mg/ml；氧化的雜質(zhì)小于15 %；尿素濃度6-6.6 M；pH 9.5-10.2；DTT 0.92-1.8 mM。設(shè)計(jì)空間的說(shuō)明見圖2D。高回收率和CPP寬泛的設(shè)計(jì)空間能夠體現(xiàn)遵循QbD的方法進(jìn)行工藝開發(fā)的價(jià)值。

　　接下來(lái)的工作是建立復(fù)性后的純化工藝。通過(guò)商業(yè)調(diào)查我們發(fā)現(xiàn)，目前應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)GCSF的工藝模式主要是：陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、疏水復(fù)合模式層析（按受歡迎程度下降的順序）。每個(gè)層析步驟能夠使用結(jié)合-洗脫模式或流穿模式。基于之前的知識(shí)和商業(yè)調(diào)查，我們決定關(guān)注用于GCSF純化的陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析以及復(fù)合模式層析進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果見圖3。

　　考慮到需要做大量的層析試驗(yàn)，我們開發(fā)了高通量工藝開發(fā)平臺(tái)。為了達(dá)到這個(gè)目的，我們選擇了GE醫(yī)療的Predictor PlateTM進(jìn)行試驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)手動(dòng)操作2-6 μl規(guī)模存在一定的挑戰(zhàn)，因此我們需要開發(fā)一個(gè)能夠有效降低這種挑戰(zhàn)的方案，最終我們將HTPD平臺(tái)和傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室0.5 ml規(guī)模的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明HTPD平臺(tái)能夠成功的用于工藝開發(fā)。雖然HTPD平臺(tái)中每一步的收率的絕對(duì)值較低，但是其趨勢(shì)是正確的。因此該平臺(tái)能夠應(yīng)用于半定量評(píng)估多種輸入?yún)?shù)的影響（圖3A）。在實(shí)際應(yīng)用之前我們認(rèn)為該模型是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。但通過(guò)進(jìn)一步調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，造成每一步收率低的原因是HTPD膜板對(duì)GCSF有非特異性吸附。而且其它一些疏水作用不強(qiáng)（比如單克隆抗體）的蛋白的非特異性吸附作用是可以忽略的。

　　一旦HTPD平臺(tái)開發(fā)成功，我們能將其用于多種層析填料和不同模式下的操作條件進(jìn)行快速篩選。首先，我們通過(guò)HTPD平臺(tái)對(duì)5家主要供應(yīng)商的9種不同的陽(yáng)離子交換層析填料進(jìn)行篩選。通過(guò)DoE的方法對(duì)每種填料的最優(yōu)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括pH和緩沖液摩爾濃度。之后要在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行洗脫策略的優(yōu)化。結(jié)合-洗脫模式的陽(yáng)離子交換層析GCSF純化的最優(yōu)結(jié)果表明，其最高回收率能達(dá)到80 %。相似的，我們通過(guò)HTPD平臺(tái)對(duì)4家主要供應(yīng)商的8種不同的陰離子交換層析填料進(jìn)行結(jié)合-洗脫和穿透模式篩選。結(jié)果表明，在結(jié)合-洗脫模式時(shí)，陰離子層析的收率小于30 %。這主要是因?yàn)樵诘蚿H（譯者認(rèn)為應(yīng)該是高pH，結(jié)合是在高pH，穿透模式是低pH）下GCSF非常不穩(wěn)定。而在穿透模式下，產(chǎn)品收率幾乎達(dá)到100 %，并且宿主細(xì)胞雜質(zhì)顯著降低（DNA約0.5個(gè)log降，HCP 大于1個(gè)log降）。最后，通過(guò)HTPD平臺(tái)對(duì)復(fù)合模式層析填料進(jìn)行評(píng)估。HTPD平臺(tái)結(jié)合傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室步驟對(duì)每種填料進(jìn)行優(yōu)化，最終僅使用復(fù)合形式填料就能使收率達(dá)到90.0 %，同時(shí)純度大于99.0 %（圖3B）。這很可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)pH和鹽濃度進(jìn)行梯度洗脫的疏水離子復(fù)合層析對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的變體的分離有特異選擇性。

　　因此，最終優(yōu)化后的工藝為：通過(guò)pH調(diào)節(jié)進(jìn)行復(fù)性——一步疏水離子復(fù)合層析。

　　iv. 定義控制策略

　　控制策略是QbD的關(guān)鍵組成部分，同時(shí)也是過(guò)程分析技術(shù)的基礎(chǔ)。在本案例中，控制策略涉及受下游純化工藝影響的產(chǎn)品相關(guān)的CQA，即氧化、還原和聚體種類。在復(fù)性和純化工序中，通過(guò)監(jiān)測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量來(lái)評(píng)估分析工具的實(shí)用性。包括：RP-HPLC、傅里葉變換紅外光譜、紫外圓二色譜、SEC-HPLC、熒光?？紤]到靈敏度、精度、分析時(shí)間和可操作性，我們決定將RP-HPLC和SEC-HPLC用于監(jiān)測(cè)GCSF復(fù)性工序，將RP-HPLC用于在線監(jiān)測(cè)復(fù)合模式純化工序的洗脫液（在線分析技術(shù)）。不同文獻(xiàn)資料表明，產(chǎn)品目標(biāo)CQA的一致性的顯著提高是我們?cè)趯?shí)施PAT策略時(shí)所愿看到的。

　　v. 描述產(chǎn)品特征

　　QbD范例中生物藥工藝開發(fā)是建立在產(chǎn)品質(zhì)量始終如一的基礎(chǔ)上的。產(chǎn)品質(zhì)量是主要的優(yōu)化目標(biāo)，比如：工藝的收率、生產(chǎn)力和生產(chǎn)周期。在本仿制藥的案例中，產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)估要與原研藥進(jìn)行可比性研究。在這個(gè)過(guò)程中，我們需要進(jìn)行大量的可比性研究分析，將我們的GCSF與原研藥和上市的GCSF仿制藥進(jìn)行對(duì)比。一些關(guān)鍵的結(jié)果見圖4。

　　該過(guò)程的第一步是確認(rèn)產(chǎn)品的身份，可通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)。圖4Ai是通過(guò)復(fù)合模型柱純化的GCSF的質(zhì)譜圖，圖4Aii是質(zhì)譜圖的去卷積質(zhì)譜圖。結(jié)果表明，GCSF仿制藥中的主要成分是GCSF蛋白，該蛋白序列中N末端帶有蛋氨酸殘基，但沒有發(fā)生糖基化。還原和非還原消化LC/MSE肽圖確定了含有N末端蛋氨酸GCSF的氨基酸序列和二硫鍵。這些結(jié)果表明我們的產(chǎn)品是GCSF，并且在整個(gè)工藝中沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變體。

　　下一步就是鑒定HCP（圖4B），因此我們選擇了二維交聯(lián)凝膠電泳和UPLC-MS。我們?cè)趶?fù)性工藝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多種HCP，我們將通過(guò)二維凝膠電泳做進(jìn)一步描述。其中一些HCP能夠被確定為典型的大腸桿菌表達(dá)蛋白。

　　最后，通過(guò)宿主分析工具進(jìn)行分析可比性評(píng)估。圖4Ci的SEC-HPLC表明GCSF產(chǎn)品和原研藥產(chǎn)品中幾乎不含有聚體（0.2 %和0.15 %）。同樣的，RP-HPLC分析結(jié)果表明通過(guò)QbD方法生產(chǎn)的GCSF蛋白的質(zhì)量與上市的原研藥或其它仿制藥相比不僅相似，而且要更好（圖4Cii）。鑒于GCSF含有α螺旋結(jié)構(gòu)，因此首要考慮的比較性質(zhì)就包括在圓二色譜中208 nm和220 nm處有下降。圖4Ciii可以看出兩個(gè)蛋白的圖譜匹配較好，這表明GCSF和市售藥都含有α螺旋結(jié)構(gòu)，而且沒有其它結(jié)構(gòu)變體。通過(guò)SDS-PAGE非還原電泳進(jìn)行高、低分子量水平的相似性比較，結(jié)果與SEC-HPLC的結(jié)果相一致，仿制藥和市售藥的質(zhì)量一致，并且?guī)缀鯖]有高分子量蛋白。最后，通過(guò)體外生物檢測(cè)法來(lái)確定GCSF的生物活性。我們的GCSF的生物效價(jià)是市售GCSF的89.3 %，在產(chǎn)品規(guī)格范圍之內(nèi)（80-120 %）。這表明了我們的GCSF保持了結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性。

　　實(shí)施QbD的益處

　　表1中的數(shù)據(jù)是通過(guò)QbD方法生產(chǎn)的GCSF蛋白的分析數(shù)據(jù)，表明其質(zhì)量達(dá)到了市售產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。此外通過(guò)圖4可以看出生產(chǎn)的GCSF要優(yōu)于市售產(chǎn)品。另外，表2比較了通過(guò)QbD方法生產(chǎn)的GCSF和市售GCSF的純化工藝。通過(guò)QbD方法生產(chǎn)的GCSF的工藝包括：通過(guò)pH調(diào)節(jié)進(jìn)行復(fù)性——過(guò)濾——復(fù)合模式層析純化。市售蛋白工藝包括：通過(guò)換液方式（超濾/透析或凝膠過(guò)濾方式）進(jìn)行復(fù)性——3到4步色譜純化（中間還要通過(guò)超濾/透析或凝膠法換液）。QbD方法得到的蛋白純化工藝不僅工藝收率提高3倍，而且工藝時(shí)間縮短3倍，因此生產(chǎn)工藝的生產(chǎn)力提高了近10倍。鑒于目前成本壓力以及生物技術(shù)行業(yè)都在關(guān)注降低生物藥生產(chǎn)成本，這是非常有意義的。

　　通過(guò)執(zhí)行上述提議的工藝將會(huì)實(shí)現(xiàn)多個(gè)主要益處，其中一些已經(jīng)在本案例中體現(xiàn)了。由于我們的試驗(yàn)數(shù)據(jù)是通過(guò)DoE試驗(yàn)（圖2D和3B）得到的，我們能夠定義更寬泛的合適的可接受范圍和操作空間。雖然寬泛的產(chǎn)品質(zhì)量規(guī)格不在本文范圍之內(nèi)，但是我們還是努力關(guān)注產(chǎn)品開發(fā)能夠達(dá)到其質(zhì)量規(guī)格。如上所述，我們提議了基于控制策略的動(dòng)態(tài)PAT技術(shù)（通過(guò)RP-HPLC和SEC-HPLC監(jiān)測(cè)GCSF的復(fù)性工序和RP-HPLC監(jiān)測(cè)其復(fù)合模式純化色譜工序），這已經(jīng)展現(xiàn)了其顯著改善產(chǎn)品一致性的能力，這能增加工藝的穩(wěn)健性。作為上述控制策略益處的一個(gè)補(bǔ)充：在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)品質(zhì)量就被檢測(cè)了，并且最終制劑的檢測(cè)項(xiàng)也會(huì)顯著降低。原液和制劑的哪些屬性需要檢測(cè)最終還是要生產(chǎn)商去決定。如圖2和圖3所示，監(jiān)管備案文件應(yīng)包括工藝和產(chǎn)品之間的聯(lián)系。這樣監(jiān)管機(jī)構(gòu)就能知道哪些參數(shù)的重要的，哪些是可接受的范圍。例如：蛋白復(fù)性案例中，pH、尿素和DTT濃度是關(guān)鍵工藝參數(shù)，基于對(duì)它們的控制能力我們規(guī)定了三個(gè)參數(shù)的合適的設(shè)計(jì)空間（圖2D）。并且我們可以給非關(guān)鍵參數(shù)規(guī)定更寬的設(shè)計(jì)空間（比如包涵體濃度），這樣我們的生產(chǎn)就會(huì)更靈活，并且監(jiān)管的壓力更小。我們希望高效的生產(chǎn)能貫穿于整個(gè)產(chǎn)品的生命周期，因?yàn)楸景咐械臄?shù)據(jù)明確的規(guī)定了設(shè)計(jì)空間，并且能夠快速的解決生產(chǎn)過(guò)程中的任何不合格問(wèn)題。最后，關(guān)于最優(yōu)工藝的生產(chǎn)力和生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性在上文中已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，包括：生產(chǎn)工藝時(shí)間算短3倍；生產(chǎn)力提高了10倍。

　　總之，我希望上面的討論能夠說(shuō)明通過(guò)QbD的實(shí)施是能得到很大益處的。

　　結(jié)束語(yǔ)

　　QbD是在2004年通過(guò)PAT指南發(fā)布時(shí)引入到生物技術(shù)行業(yè)的。在過(guò)去的十年里，在生物技術(shù)企業(yè)和其監(jiān)管機(jī)構(gòu)的共同努力下，對(duì)QbD實(shí)施的路線圖進(jìn)行了說(shuō)明。當(dāng)大家普遍的接受了這個(gè)概念，并且多數(shù)大的生產(chǎn)企業(yè)已經(jīng)處在將QbD整合到各種工作中的高級(jí)階段時(shí)，中小生產(chǎn)企業(yè)還在為QbD的成功實(shí)施進(jìn)行不懈努力。對(duì)本案例的分析主要是為了通過(guò)展示QbD方法的益處來(lái)推廣QbD。QbD的實(shí)施通常是資源集中的。本研究是兩個(gè)全職等效資源的成果，這比生物技術(shù)企業(yè)在相似的工藝開發(fā)中所花費(fèi)的資源要小的多。

　　我希望有更多的這樣的研究能夠分享到公共領(lǐng)域，因?yàn)檫@不僅能回答實(shí)施QbD所面臨的各種問(wèn)題，而且為實(shí)施QbD闡明了必要的商業(yè)驅(qū)動(dòng)。