定量代謝組學研究進展（獨家原創(chuàng)）

　　定量代謝組學研究進展

　　鄭?；?，陳明毅1，鐘丹敏1，韓博2，焦依楊1，魏琳1，謝智勇1, 3*

　?。?. 中山大學藥學院，廣東 廣州 510006； 2. 石河子大學藥學院，新疆 石河子 832003；3. 廣東省疾病模式動物工程技術研究中心，廣東廣州 510006）

　　[ 摘要] 定量代謝組學可通過鑒定機體內所有的代謝產物，并測定其量及量的變化，用于考察機體在受到外界刺激或干擾時的代謝變化。借助定量代謝組學平臺，對靶代謝物進行精確定量，有利于發(fā)現潛在的生物標志物以及闡釋發(fā)病機制和藥物作用機制，對疾病的早期診斷和防治起指導作用。綜述定量代謝組學的實驗流程、分析技術、定量方法及應用。

　　[ 關鍵詞] 定量代謝組學；分析技術；定量方法；生物標志物；疾病早期診斷；藥物作用機制

　　代謝組學是研究生物體系受刺激或干擾（某個特定基因變異或環(huán)境改變）后其代謝產物（相對分子質量一般小于1 000）變化或隨時間變化規(guī)律的一門學科，用于研究生物體系的代謝途徑。代謝組學以組群指標分析為基礎，采用高靈敏度、高通量和高特異性的現代分析儀器技術，并結合模式識別等多變量統(tǒng)計數據分析方法，研究機體在受外界干擾后其代謝產物的變化規(guī)律。如今“四大組學”（基因組學、轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學）構成了系統(tǒng)生物學整體，由于代謝組學處于生命信息傳遞鏈終端，故可體現出生物體系整體狀態(tài)或功能的最終結果。而根據代謝組學研究目的的不同，可將其研究模式分為2 種：靶標代謝組學（即“特寫” 模式）與非靶標代謝組學（即“全景”模式）。近年來，代謝組學向著一體化、定量化與標準化方向發(fā)展，而由于非靶標代謝組學只能對代謝物進行定性或半定量測定，其已無法滿足研究與應用對精確定量的需求，故靶標代謝組學已成為代謝組學的發(fā)展趨勢。本文就定量代謝組學的實驗流程、分析技術、定量方法及應用作一綜述。

　　1 定量代謝組學實驗流程

　　定量代謝組學實驗流程包括數據采集、數據處理和數據分析等步驟（見圖1），而數據處理和數據分析二者合稱為定量代謝組學的研究平臺，其對定量代謝組學的發(fā)展具有至關重要的作用。

　　生物樣品（如尿液）采集后，需先經生物反應預處理，采用核磁共振（NMR）、質譜聯用等技術獲得代謝譜或代謝指紋譜，再使用模式識別等化學計量學方法，對所獲多維數據降維處理與進一步信息挖掘，研究相關代謝物所涉及的代謝途徑和變化規(guī)律，以解釋生物體對相應刺激的反應機制。定量代謝組學是在得到代謝指紋譜的基礎上加上量化指標，即“全景+ 特寫”，使相應的研究更具有全面化及可靠性。

　　1.1 數據采集

　　代謝組學研究對象大多數是生物樣品，如生物體液（唾液、血液、尿液等）、組織提取液、細胞培養(yǎng)液及糞便等。由于生物樣本易受殘留酶活性或氧化還原反應等的影響，需要對所采集的樣品進行快速淬滅處理，以免其生物活性遭破壞，如立即進行液氮冷凍或酸處理等。采集的生物樣品一般需放置于無菌玻璃裝置或含殺菌劑（如疊氮鈉）的塑料裝置中，且由于樣品長期暴露于室溫下會導致很多代謝物濃度發(fā)生明顯改變，故其還需置- 80℃冷藏。而當采集的生物樣品為組織提取物時，應避免其與強酸（如高氯酸）接觸，因強酸可與樣品發(fā)生化學反應而導致其代謝輪廓改變。

　　不同類型的生物樣品需采用不同的預處理方法，如不含蛋白的生物樣品（尿液）可不經預處理而直接進行分析；但含蛋白或脂蛋白的生物樣品（血清、血漿及組織提取液）則必須通過預處理，除去蛋白等大分子；在處理生物樣品時，除了要避免微生物污染，還要防止其他污染物（如凝膠、肝素等）的引入，因為這些污染物的信號有可能會掩蓋一些代謝物的信號，有時還會被誤認為未知代謝物，影響數據分析。

　　1.2 數據處理

　　目前，在代謝組學研究領域，獲取數據所采用的分析技術主要有NMR 以及LC-MS、GC-MS 等質譜聯用技術。由于單用各技術，各有利弊，故多種分析技術聯用，已成為當今的發(fā)展趨勢。而經各分析平臺得到的數據，均為原始數據，須經預處理及模式識別。

　　1.3 數據分析

　　在對代謝物進行定量測定后，同時借助一些生化數據庫，如KEGG、METLIN 和HMDB（用于代謝物生物功能解釋和代謝通路分析），對所測數據進行統(tǒng)計分析，比較數據間差異，進一步驗證代謝物與生物通路的關系。常用于分析的統(tǒng)計軟件需要能夠執(zhí)行t 檢驗配對比較或方差的分析程序，如SPSS、Origin 等。同時，通過Metaboanalyst 、KEGG 等軟件，可以得到目標代謝通路，闡述病理生理、藥物作用等相關機制。

　　2 定量代謝組學分析技術

　　設計實驗時，研究者往往需根據實驗目的和對象，選擇合適分析方法。在進行代謝組學實驗設計時，鑒于眾多小分子代謝物及生物體系復雜性，即要求代謝組學的分析方法應具有高靈敏度、高特異性以及高通量的特點。目前，代謝組學研究中所運用的分析技術有色譜、MS、NMR、傅里葉變換紅外線光譜（FTIR）、LC-MS、GC-MS 和毛細管電泳-質譜聯用（CE-MS）等，而用于定量代謝組學的分析手段主要有NMR、GC-MS 和LC-MS。在對目標代謝物進行定量分析時，不同的分析技術其定量方法有所不同，如表1 所示。

　　2.1 核磁共振

　　基于NMR 的定量測定一般采用內標絕對定量法，也有用相對比較法。NMR 定量方法是通過比較不同化合物的吸收峰強度而進行定量，即根據已確定化合物質子的信號強度與產生該信號的質子數目成正比的原則，通過對目標化合物某一基團質子峰面積與內標物峰面積進行比較，即可求出絕對含量。在利用內標法或相對比較法進行生物混合物分析時，只需在建立標準代謝物圖譜庫的基礎上，利用內標物進行比較，即可求出目標代謝物的絕對含量，并不需要獲得該代謝物的純品用作對照。江春迎采用基于NMR 的定量代謝組學技術，對金黃地鼠脂代謝紊亂模型進行跟蹤研究及調血脂藥物的藥效學評價。結果發(fā)現，在高脂金黃地鼠中，與年輕組相比，老齡組地鼠血液中葡萄糖含量較高而檸檬酸含量較低，尿液中檸檬酸和順烏頭酸含量均較低，即老齡組糖酵解循環(huán)失衡進一步加?。欢诮o予中藥單體成分（大黃素、姜黃素等）和新調血脂化合物WS090508 及WS090138 干預后，高脂血癥地鼠的血漿代謝輪廓均有正常回歸趨勢，說明這些受試化合物均具有調血脂功效?？梢姡捎没贜MR 的定量代謝組學技術，能系統(tǒng)觀察到生物體代謝紊亂發(fā)生、發(fā)展及藥物干預后其相關循環(huán)途徑的時空變化規(guī)律，可彌補傳統(tǒng)藥理學研究技術方法的不足。

　　2.2 色譜- 質譜聯用

　　色譜-質譜聯用可分為LC-MS 和GC-MS，用其作為定量分析技術時，首先，需要對標準化合物進行測定，確定標準化合物準分子離子和色譜保留時間；然后，優(yōu)化離子碰撞能量，確定母離子與子離子；最后，通過子離子碎片，為定量提供質譜和色譜參考。該項分析技術常用定量方法有外標法和內標法，而內標法最為常用。

　　GC-MS 適用于分析熱穩(wěn)定性好以及具有揮發(fā)性的化合物，對于那些難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性較差或極性強的物質則需衍生化后再進行分析，其具有較高的準確度和靈敏度。Quéro 等對植物中極性代謝物進行TMS 衍生化后，再采用GC-MS 進行定量檢測。Berkov 等采用GC-MS 法，對不同種屬植物中的加蘭他敏進行定量檢測，并且采用主成分分析方法（PCA）對其進行成功分組。

　　LC-MS 具有高靈敏度、高選擇性且測試時不受樣品穩(wěn)定性和揮發(fā)性影響等優(yōu)點。Ma 等采用UPLC-QTOFMS方法，對半乳糖胺誘導的中國小型豬急性肝損傷模型中生物標志物進行半定量檢測，結果發(fā)現，模型豬血清中溶血磷脂酰膽堿類、卵磷脂及脂肪酸酰胺含量較正常水平有所下降。Li 等建立UHPLC-MS-MS 方法，對長期暴露于乙草胺的大鼠的尿液進行代謝組學研究，結果發(fā)現，模型大鼠尿液中馬尿酸、檸檬酸、泛酸、尿嘧啶等含量均較正常水平有所降低。Hou 等建立UPLC-MS/MS 方法，同時測定大鼠血漿與尿液樣品中3 種芳香類氨基酸分別為苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，以及4 個腸道菌群及其宿主共代謝物分別為吲哚、對甲酚、硫酸吲哚和硫酸對甲酚。而且，Hou 所在課題組又通過建立HILIC-MS/MS 方法，同時測定了大鼠尿樣中32 種氨基酸、神經遞質、嘌呤和嘧啶的含量；并將建立的定量代謝組學分析方法（UPLC-MS/MS 和HILIC-MS/MS）應用于從克羅恩病模型大鼠（以2,4,6-三硝基苯磺酸誘導）中所獲生物樣品，對模型大鼠腸道菌群及其宿主共代謝物進行分析，全面系統(tǒng)探討了2,4,6-三硝基苯磺酸誘導的克羅恩病模型對大鼠腸道菌群和機體的影響，其間，運用所建立的分析方法，在10 min 內，對11 種關鍵的腸道菌群及其宿主共代謝物進行了快速定量檢測，其中主要包括琥珀酸類、苯乙酰谷氨酰胺類、馬尿酸鹽以及三甲胺等代謝物。可見，采用這類新方法，可為腸道菌群紊亂相關疾?。ㄈ鐫冃越Y腸炎、克羅恩病及肥胖等）的發(fā)生、發(fā)展機制研究提供一種新的手段。

　　2.3 多種分析技術聯用

　　如今代謝組學向著一體化、定量化及整合化趨勢發(fā)展，而整合化發(fā)展不僅需要內部之間整合（如各檢測技術間整合、各數據處理方法間整合等），還需要同外部進行整合（如與其他組學間整合分析）。由于各種分析技術各有利弊，且代謝組學研究對象復雜，有時候單用一種柱子或檢測器并不能滿足定性定量的分析要求，所以，多種分析技術聯用，已然成為一種趨勢。劉妍如聯合應用NMR和HPLC-MS/MS，對更年期綜合征發(fā)病和貫葉連翹治療更年期綜合征的機制進行研究，并結合偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA) 和方差分析，對所獲代謝物進行篩選，結果發(fā)現了53 個與更年期綜合征診斷相關的差異表達代謝物；且在構建代謝網絡后，發(fā)現有6 條代謝通路與更年期綜合征顯著相關。提示，將多種分析技術和多元統(tǒng)計方法相結合的研究策略，能實現在代謝物水平上對疾病發(fā)生發(fā)展和藥物作用的機制研究。

　　在代謝組學研究領域，現在除了聯合應用多種分析技術外，多維NMR 技術以及多維色譜-質譜聯用技術的應用也成為一種趨勢。Martineau 等采用2D NMR，對3 種不同的乳腺癌細胞提取物中15 種代謝物進行絕對定量檢測，發(fā)現3 種不同細胞株中的這15 種代謝物含量具有顯著差異。Kim 等采用基于質量的激光解吸/ 電離質譜（MALDI-MS）平臺，對人乳腺癌細胞中的雌酮（雌酮與乳腺癌的發(fā)生有著重要關聯）進行定量檢測。由于雌酮低豐度原因，對其進行定量監(jiān)控有很大難度，而借助MALDI-MS 平臺，則可測其絕對濃度，且該平臺可測任何含酮體代謝物，從而能反映臨床治療情況以及探討疾病機制。

　　3 定量代謝組學定量方法

　　隨著分析技術的發(fā)展，其相應的定量方法也在不斷發(fā)展。標準曲線法雖是定量代謝組學研究中最常用的方法，可由于代謝物的復雜性，且相應對照品匱乏，均給代謝物的定量分析帶來較大困難。于是，在定量代謝組學研究領域，人們開拓創(chuàng)新，不斷提出新的定量方法，以滿足需求。

　　與標準曲線法相比，內標法更具有普適性，因其不需要對照品，只需選擇合適的內標物質即可，故在內標法中，選擇合適的內標，顯得尤為重要。近年來，同位素標記內標法在定量代謝組學研究領域亦得到廣泛應用，該法采用同位素標記選定好的內標物，將標記后的內標物與樣品混合進行分析，再根據同位素信號，計算得到相關待測物的含量，常用同位素有13C和1H。Yang 等建立GC-MS法，用13C 標記化合物，對扭脫甲基桿菌AM1 中的代謝物進行綜合分析和部分定量。Lien 等采用非氖化與氘化衍生化試劑二者相結合處理內標物的方法，對有機酸類、氨基酸類、糖醇類以及碳水化合物類等代謝物進行了定量檢測。Yang 等則論述了GC-MS 結合化學計量學方法及13C 和12C 標記化合物在代謝組學定量以及13C 流束分析中的應用。

　　在定量代謝組學研究領域，基于定量NMR（QNMR）技術的應用主要有2 種定量方法：Binning 法和靶標輪廓法。Binning 法作為傳統(tǒng)代謝組NMR 圖譜分析法，其主要存在兩方面缺陷：一是，對pH 和離子強度變化所引起的化學位移偏差適應性較差，導致其分析結果可靠性不強；二是，所獲分析結果不一定具有實際意義。而靶標輪廓法并不是依靠積分面積對待測物濃度進行半定量測定，其首先借助數據庫對代謝物進行較精確的定性，然后用內標法測定其絕對濃度。借助某些商業(yè)軟件，靶標輪廓法通過去卷積和線性疊加方法對NMR 譜圖進行擬合，既可解決因譜峰重疊而造成定性分析困難的問題，亦可增加定量分析準確性（受pH 和離子強度影響較?。?，因此具有一定的實用性。

　　雖然內標法和靶標輪廓法可以滿足代謝物定量分析的需要，但其用于定量分析，亦受到一定的限制，因為定量數據處理和分析均需依靠各種軟件，如應用于NMR儀器平臺的rNMR  以及應用于GC-MS 儀器平臺的MetaQuant 、ADAP-GC  和TagFinder  等軟件， 即不同儀器平臺用于代謝產物的定量分析時，需要相應的專用軟件支持。而且，像Agilent 公司的MassHunter 軟件，雖包含定量功能，但存在導出結果無法直接導入其他軟件以及操作較復雜等缺點。因此，如今對代謝物進行定量分析時，仍然主要采用基于峰強度信息的人工操作方式。鑒于此現狀，衛(wèi)潤民等基于Matlab 平臺，開發(fā)了一款適用于代謝產物批量定量的工具（batched metabolitequantification tool，BQT），且其已獲得軟件著作權（2011SR081319）。該軟件具有以下特點: 1）可對多個代謝物同時進行定量；2）支持Excel 格式文檔導入和導出；3）可提供對數變換以及缺失值填補等基本數據預處理功能。該軟件可使從儀器平臺的測試結果到數據統(tǒng)計分析之間的定量過程自動化，使批量樣本的定量任務大大簡化，彌補了由人工操作帶來的缺陷和不便。

　　4 定量代謝組學的應用

　　隨著代謝物定量研究的深入，代謝組學由定性或是半定量的非靶標研究向準確定量的靶標研究轉變。同時，定量代謝組學研究具有全面性及準確性等特點，可應用于醫(yī)藥學各個領域，如疾病早期診斷、藥物作用機制、環(huán)境領域、毒理學研究、微生物領域以及植物學等。該部分簡要介紹在疾病早期診斷和藥物作用機制兩方面有關定量代謝組學的一些應用。

　　4.1 用于疾病早期診斷

　　由于代謝組學處于生命信息傳遞鏈終端，故可體現生物體系整體狀態(tài)或功能的最終結果。一旦機體出現病理變化，其基礎代謝亦會發(fā)生相應的改變，從而導致體內小分子代謝物的濃度或種類發(fā)生改變，即代謝譜圖發(fā)生變化，而這種變化可能比臨床癥狀出現得更早。鑒于此，可借助定量代謝組學平臺，研究與疾病相關的生物標志物，對疾病進行早期診斷，預防疾病的進一步發(fā)展。目前，定量代謝組學已應用于惡性腫瘤以及心血管和呼吸系統(tǒng)等的疾病早期診斷。吳澤明等采用LC-MS 方法，對黑膽質證哮喘患者血清進行代謝組學研究，發(fā)現15 個與哮喘疾病相關的生物標志物，如在哮喘患者的血液中，硬脂酰胺含量升高，而溶血磷脂酰膽堿類物質的含量降低。近期，有研究人員將蛋白質組學與代謝組學相結合進行研究，同樣也發(fā)現，在哮喘患者血液中，磷脂酰膽堿含量均上升，而溶血磷脂酰膽堿含量均降低。這為之前的研究提供了印證及補充，即磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿的含量變化特征是哮喘患者一種標志性的代謝模式，可作為診斷哮喘的一種輔助手段?？梢姡柚看x組學平臺，找出與疾病相關的生物標志物，并對其定量分析，可對疾病進行早期診斷，以防疾病繼續(xù)惡化發(fā)展。West 等采用UPLCMS/MS 法，對擴張型心肌?。―CM）模型小鼠心臟組織中與心臟代謝相關的130 多種代謝物進行定量測定，其中包括三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、糖酵解以及氨基酸代謝等途徑的代謝產物。結果發(fā)現，DCM 模型小鼠心臟組織中，脯氨酸及甲基化組氨酸含量升高，提示肌纖維增加以及膠原蛋白降解；而且，一些三羧酸循環(huán)中間體以及肉毒堿衍生物含量下降，表明衰竭心臟其能量代謝下降。鑒于該方法可定量測定心血管疾病中一些關鍵代謝途徑，且覆蓋面廣，故借助該方法，可對心血管疾病進行評定與診斷。

　　4.2 用于藥物作用機制研究

　　中藥成分復雜，以中醫(yī)藥理論指導用藥的中成藥或中藥復方用于治療疾病的作用機制，一直未能得到國際上的認可，嚴重阻礙了中醫(yī)藥走出國門的步伐。而代謝組學位于生物系統(tǒng)信息傳遞鏈的終端，它能在代謝物水平上告訴我們自身機體已經發(fā)生什么，即代謝組學可用于幫助人們理解病變過程和體內物質代謝途徑，也可根據某些指標水平變化來闡述藥物作用機制或功效，故代謝組學可成為一種解釋中藥作用機制的有效手段。鐘宏福等應用定量代謝組學方法，研究天芪降糖膠囊（含黃芪、女貞子、人參、五倍子和黃連等）對糖耐量受損（IGT）患者體內嘌呤嘧啶代謝的干預作用，其間，采用HPLC-二極管陣列檢測器（DAD）-MS-MS 法，對9 種嘌呤嘧啶類代謝物（潛在生物標志物）進行定量檢測。結果發(fā)現，3 種代謝物（尿酸、黃嘌呤和肌酐）與糖尿病前期IGT 患者相關性較大，且尿酸與肌酐清除率呈負相關，其他6 種代謝物與正常組相比差異性較小。劉妍如采用基于NMR 和HPLC-MS/MS的定量代謝組學方法，研究貫葉連翹用于治療更年期綜合征的作用機制。結果發(fā)現，貫葉連翹主要通過調節(jié)肝臟代謝中精氨酸、鳥氨酸、蛋氨酸、?；撬?/a>、肉毒堿和三羧酸循環(huán)中間代謝產物的水平，其次使膽堿和甜菜堿生成正常，從而改善脾臟的退行性變化，增強脾臟的抗炎作用，達到治療與炎癥效應相關的更年期綜合征等疾病的效果。