定量代謝組學(xué)研究進展（獨家原創(chuàng)）

　　定量代謝組學(xué)研究進展

　　鄭海慧1，陳明毅1，鐘丹敏1，韓博2，焦依楊1，魏琳1，謝智勇1, 3*

　　（1. 中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2. 石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832003；3. 廣東省疾病模式動物工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510006）

　　[ 摘要] 定量代謝組學(xué)可通過鑒定機體內(nèi)所有的代謝產(chǎn)物，并測定其量及量的變化，用于考察機體在受到外界刺激或干擾時的代謝變化。借助定量代謝組學(xué)平臺，對靶代謝物進行精確定量，有利于發(fā)現(xiàn)潛在的生物標志物以及闡釋發(fā)病機制和藥物作用機制，對疾病的早期診斷和防治起指導(dǎo)作用。綜述定量代謝組學(xué)的實驗流程、分析技術(shù)、定量方法及應(yīng)用。

　　[ 關(guān)鍵詞] 定量代謝組學(xué)；分析技術(shù)；定量方法；生物標志物；疾病早期診斷；藥物作用機制

　　代謝組學(xué)是研究生物體系受刺激或干擾（某個特定基因變異或環(huán)境改變）后其代謝產(chǎn)物（相對分子質(zhì)量一般小于1 000）變化或隨時間變化規(guī)律的一門學(xué)科，用于研究生物體系的代謝途徑。代謝組學(xué)以組群指標分析為基礎(chǔ)，采用高靈敏度、高通量和高特異性的現(xiàn)代分析儀器技術(shù)，并結(jié)合模式識別等多變量統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析方法，研究機體在受外界干擾后其代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。如今“四大組學(xué)”（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)）構(gòu)成了系統(tǒng)生物學(xué)整體，由于代謝組學(xué)處于生命信息傳遞鏈終端，故可體現(xiàn)出生物體系整體狀態(tài)或功能的最終結(jié)果。而根據(jù)代謝組學(xué)研究目的的不同，可將其研究模式分為2 種：靶標代謝組學(xué)（即“特寫” 模式）與非靶標代謝組學(xué)（即“全景”模式）。近年來，代謝組學(xué)向著一體化、定量化與標準化方向發(fā)展，而由于非靶標代謝組學(xué)只能對代謝物進行定性或半定量測定，其已無法滿足研究與應(yīng)用對精確定量的需求，故靶標代謝組學(xué)已成為代謝組學(xué)的發(fā)展趨勢。本文就定量代謝組學(xué)的實驗流程、分析技術(shù)、定量方法及應(yīng)用作一綜述。

　　1 定量代謝組學(xué)實驗流程

　　定量代謝組學(xué)實驗流程包括數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析等步驟（見圖1），而數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析二者合稱為定量代謝組學(xué)的研究平臺，其對定量代謝組學(xué)的發(fā)展具有至關(guān)重要的作用。

　　生物樣品（如尿液）采集后，需先經(jīng)生物反應(yīng)預(yù)處理，采用核磁共振（NMR）、質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)獲得代謝譜或代謝指紋譜，再使用模式識別等化學(xué)計量學(xué)方法，對所獲多維數(shù)據(jù)降維處理與進一步信息挖掘，研究相關(guān)代謝物所涉及的代謝途徑和變化規(guī)律，以解釋生物體對相應(yīng)刺激的反應(yīng)機制。定量代謝組學(xué)是在得到代謝指紋譜的基礎(chǔ)上加上量化指標，即“全景+ 特寫”，使相應(yīng)的研究更具有全面化及可靠性。

　　1.1 數(shù)據(jù)采集

　　代謝組學(xué)研究對象大多數(shù)是生物樣品，如生物體液（唾液、血液、尿液等）、組織提取液、細胞培養(yǎng)液及糞便等。由于生物樣本易受殘留酶活性或氧化還原反應(yīng)等的影響，需要對所采集的樣品進行快速淬滅處理，以免其生物活性遭破壞，如立即進行液氮冷凍或酸處理等。采集的生物樣品一般需放置于無菌玻璃裝置或含殺菌劑（如疊氮鈉）的塑料裝置中，且由于樣品長期暴露于室溫下會導(dǎo)致很多代謝物濃度發(fā)生明顯改變，故其還需置- 80℃冷藏。而當采集的生物樣品為組織提取物時，應(yīng)避免其與強酸（如高氯酸）接觸，因強酸可與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而導(dǎo)致其代謝輪廓改變。

　　不同類型的生物樣品需采用不同的預(yù)處理方法，如不含蛋白的生物樣品（尿液）可不經(jīng)預(yù)處理而直接進行分析；但含蛋白或脂蛋白的生物樣品（血清、血漿及組織提取液）則必須通過預(yù)處理，除去蛋白等大分子；在處理生物樣品時，除了要避免微生物污染，還要防止其他污染物（如凝膠、肝素等）的引入，因為這些污染物的信號有可能會掩蓋一些代謝物的信號，有時還會被誤認為未知代謝物，影響數(shù)據(jù)分析。

　　1.2 數(shù)據(jù)處理

　　目前，在代謝組學(xué)研究領(lǐng)域，獲取數(shù)據(jù)所采用的分析技術(shù)主要有NMR 以及LC-MS、GC-MS 等質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。由于單用各技術(shù)，各有利弊，故多種分析技術(shù)聯(lián)用，已成為當今的發(fā)展趨勢。而經(jīng)各分析平臺得到的數(shù)據(jù)，均為原始數(shù)據(jù)，須經(jīng)預(yù)處理及模式識別。

　　1.3 數(shù)據(jù)分析

　　在對代謝物進行定量測定后，同時借助一些生化數(shù)據(jù)庫，如KEGG、METLIN 和HMDB（用于代謝物生物功能解釋和代謝通路分析），對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，比較數(shù)據(jù)間差異，進一步驗證代謝物與生物通路的關(guān)系。常用于分析的統(tǒng)計軟件需要能夠執(zhí)行t 檢驗配對比較或方差的分析程序，如SPSS、Origin 等。同時，通過Metaboanalyst 、KEGG 等軟件，可以得到目標代謝通路，闡述病理生理、藥物作用等相關(guān)機制。

　　2 定量代謝組學(xué)分析技術(shù)

　　設(shè)計實驗時，研究者往往需根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯ο?，選擇合適分析方法。在進行代謝組學(xué)實驗設(shè)計時，鑒于眾多小分子代謝物及生物體系復(fù)雜性，即要求代謝組學(xué)的分析方法應(yīng)具有高靈敏度、高特異性以及高通量的特點。目前，代謝組學(xué)研究中所運用的分析技術(shù)有色譜、MS、NMR、傅里葉變換紅外線光譜（FTIR）、LC-MS、GC-MS 和毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）等，而用于定量代謝組學(xué)的分析手段主要有NMR、GC-MS 和LC-MS。在對目標代謝物進行定量分析時，不同的分析技術(shù)其定量方法有所不同，如表1 所示。

　　2.1 核磁共振

　　基于NMR 的定量測定一般采用內(nèi)標絕對定量法，也有用相對比較法。NMR 定量方法是通過比較不同化合物的吸收峰強度而進行定量，即根據(jù)已確定化合物質(zhì)子的信號強度與產(chǎn)生該信號的質(zhì)子數(shù)目成正比的原則，通過對目標化合物某一基團質(zhì)子峰面積與內(nèi)標物峰面積進行比較，即可求出絕對含量。在利用內(nèi)標法或相對比較法進行生物混合物分析時，只需在建立標準代謝物圖譜庫的基礎(chǔ)上，利用內(nèi)標物進行比較，即可求出目標代謝物的絕對含量，并不需要獲得該代謝物的純品用作對照。江春迎采用基于NMR 的定量代謝組學(xué)技術(shù)，對金黃地鼠脂代謝紊亂模型進行跟蹤研究及調(diào)血脂藥物的藥效學(xué)評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高脂金黃地鼠中，與年輕組相比，老齡組地鼠血液中葡萄糖含量較高而檸檬酸含量較低，尿液中檸檬酸和順烏頭酸含量均較低，即老齡組糖酵解循環(huán)失衡進一步加?。欢诮o予中藥單體成分（大黃素、姜黃素等）和新調(diào)血脂化合物WS090508 及WS090138 干預(yù)后，高脂血癥地鼠的血漿代謝輪廓均有正?；貧w趨勢，說明這些受試化合物均具有調(diào)血脂功效?？梢?，采用基于NMR 的定量代謝組學(xué)技術(shù)，能系統(tǒng)觀察到生物體代謝紊亂發(fā)生、發(fā)展及藥物干預(yù)后其相關(guān)循環(huán)途徑的時空變化規(guī)律，可彌補傳統(tǒng)藥理學(xué)研究技術(shù)方法的不足。

　　2.2 色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用

　　色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可分為LC-MS 和GC-MS，用其作為定量分析技術(shù)時，首先，需要對標準化合物進行測定，確定標準化合物準分子離子和色譜保留時間；然后，優(yōu)化離子碰撞能量，確定母離子與子離子；最后，通過子離子碎片，為定量提供質(zhì)譜和色譜參考。該項分析技術(shù)常用定量方法有外標法和內(nèi)標法，而內(nèi)標法最為常用。

　　GC-MS 適用于分析熱穩(wěn)定性好以及具有揮發(fā)性的化合物，對于那些難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性較差或極性強的物質(zhì)則需衍生化后再進行分析，其具有較高的準確度和靈敏度。Quéro 等對植物中極性代謝物進行TMS 衍生化后，再采用GC-MS 進行定量檢測。Berkov 等采用GC-MS 法，對不同種屬植物中的加蘭他敏進行定量檢測，并且采用主成分分析方法（PCA）對其進行成功分組。

　　LC-MS 具有高靈敏度、高選擇性且測試時不受樣品穩(wěn)定性和揮發(fā)性影響等優(yōu)點。Ma 等采用UPLC-QTOFMS方法，對半乳糖胺誘導(dǎo)的中國小型豬急性肝損傷模型中生物標志物進行半定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型豬血清中溶血磷脂酰膽堿類、卵磷脂及脂肪酸酰胺含量較正常水平有所下降。Li 等建立UHPLC-MS-MS 方法，對長期暴露于乙草胺的大鼠的尿液進行代謝組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型大鼠尿液中馬尿酸、檸檬酸、泛酸、尿嘧啶等含量均較正常水平有所降低。Hou 等建立UPLC-MS/MS 方法，同時測定大鼠血漿與尿液樣品中3 種芳香類氨基酸分別為苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，以及4 個腸道菌群及其宿主共代謝物分別為吲哚、對甲酚、硫酸吲哚和硫酸對甲酚。而且，Hou 所在課題組又通過建立HILIC-MS/MS 方法，同時測定了大鼠尿樣中32 種氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)、嘌呤和嘧啶的含量；并將建立的定量代謝組學(xué)分析方法（UPLC-MS/MS 和HILIC-MS/MS）應(yīng)用于從克羅恩病模型大鼠（以2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)）中所獲生物樣品，對模型大鼠腸道菌群及其宿主共代謝物進行分析，全面系統(tǒng)探討了2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的克羅恩病模型對大鼠腸道菌群和機體的影響，其間，運用所建立的分析方法，在10 min 內(nèi)，對11 種關(guān)鍵的腸道菌群及其宿主共代謝物進行了快速定量檢測，其中主要包括琥珀酸類、苯乙酰谷氨酰胺類、馬尿酸鹽以及三甲胺等代謝物?？梢姡捎眠@類新方法，可為腸道菌群紊亂相關(guān)疾?。ㄈ鐫冃越Y(jié)腸炎、克羅恩病及肥胖等）的發(fā)生、發(fā)展機制研究提供一種新的手段。

　　2.3 多種分析技術(shù)聯(lián)用

　　如今代謝組學(xué)向著一體化、定量化及整合化趨勢發(fā)展，而整合化發(fā)展不僅需要內(nèi)部之間整合（如各檢測技術(shù)間整合、各數(shù)據(jù)處理方法間整合等），還需要同外部進行整合（如與其他組學(xué)間整合分析）。由于各種分析技術(shù)各有利弊，且代謝組學(xué)研究對象復(fù)雜，有時候單用一種柱子或檢測器并不能滿足定性定量的分析要求，所以，多種分析技術(shù)聯(lián)用，已然成為一種趨勢。劉妍如聯(lián)合應(yīng)用NMR和HPLC-MS/MS，對更年期綜合征發(fā)病和貫葉連翹治療更年期綜合征的機制進行研究，并結(jié)合偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA) 和方差分析，對所獲代謝物進行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了53 個與更年期綜合征診斷相關(guān)的差異表達代謝物；且在構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)后，發(fā)現(xiàn)有6 條代謝通路與更年期綜合征顯著相關(guān)。提示，將多種分析技術(shù)和多元統(tǒng)計方法相結(jié)合的研究策略，能實現(xiàn)在代謝物水平上對疾病發(fā)生發(fā)展和藥物作用的機制研究。

　　在代謝組學(xué)研究領(lǐng)域，現(xiàn)在除了聯(lián)合應(yīng)用多種分析技術(shù)外，多維NMR 技術(shù)以及多維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用也成為一種趨勢。Martineau 等采用2D NMR，對3 種不同的乳腺癌細胞提取物中15 種代謝物進行絕對定量檢測，發(fā)現(xiàn)3 種不同細胞株中的這15 種代謝物含量具有顯著差異。Kim 等采用基于質(zhì)量的激光解吸/ 電離質(zhì)譜（MALDI-MS）平臺，對人乳腺癌細胞中的雌酮（雌酮與乳腺癌的發(fā)生有著重要關(guān)聯(lián)）進行定量檢測。由于雌酮低豐度原因，對其進行定量監(jiān)控有很大難度，而借助MALDI-MS 平臺，則可測其絕對濃度，且該平臺可測任何含酮體代謝物，從而能反映臨床治療情況以及探討疾病機制。

　　3 定量代謝組學(xué)定量方法

　　隨著分析技術(shù)的發(fā)展，其相應(yīng)的定量方法也在不斷發(fā)展。標準曲線法雖是定量代謝組學(xué)研究中最常用的方法，可由于代謝物的復(fù)雜性，且相應(yīng)對照品匱乏，均給代謝物的定量分析帶來較大困難。于是，在定量代謝組學(xué)研究領(lǐng)域，人們開拓創(chuàng)新，不斷提出新的定量方法，以滿足需求。

　　與標準曲線法相比，內(nèi)標法更具有普適性，因其不需要對照品，只需選擇合適的內(nèi)標物質(zhì)即可，故在內(nèi)標法中，選擇合適的內(nèi)標，顯得尤為重要。近年來，同位素標記內(nèi)標法在定量代謝組學(xué)研究領(lǐng)域亦得到廣泛應(yīng)用，該法采用同位素標記選定好的內(nèi)標物，將標記后的內(nèi)標物與樣品混合進行分析，再根據(jù)同位素信號，計算得到相關(guān)待測物的含量，常用同位素有13C和1H。Yang 等建立GC-MS法，用13C 標記化合物，對扭脫甲基桿菌AM1 中的代謝物進行綜合分析和部分定量。Lien 等采用非氖化與氘化衍生化試劑二者相結(jié)合處理內(nèi)標物的方法，對有機酸類、氨基酸類、糖醇類以及碳水化合物類等代謝物進行了定量檢測。Yang 等則論述了GC-MS 結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法及13C 和12C 標記化合物在代謝組學(xué)定量以及13C 流束分析中的應(yīng)用。

　　在定量代謝組學(xué)研究領(lǐng)域，基于定量NMR（QNMR）技術(shù)的應(yīng)用主要有2 種定量方法：Binning 法和靶標輪廓法。Binning 法作為傳統(tǒng)代謝組NMR 圖譜分析法，其主要存在兩方面缺陷：一是，對pH 和離子強度變化所引起的化學(xué)位移偏差適應(yīng)性較差，導(dǎo)致其分析結(jié)果可靠性不強；二是，所獲分析結(jié)果不一定具有實際意義。而靶標輪廓法并不是依靠積分面積對待測物濃度進行半定量測定，其首先借助數(shù)據(jù)庫對代謝物進行較精確的定性，然后用內(nèi)標法測定其絕對濃度。借助某些商業(yè)軟件，靶標輪廓法通過去卷積和線性疊加方法對NMR 譜圖進行擬合，既可解決因譜峰重疊而造成定性分析困難的問題，亦可增加定量分析準確性（受pH 和離子強度影響較?。?，因此具有一定的實用性。

　　雖然內(nèi)標法和靶標輪廓法可以滿足代謝物定量分析的需要，但其用于定量分析，亦受到一定的限制，因為定量數(shù)據(jù)處理和分析均需依靠各種軟件，如應(yīng)用于NMR儀器平臺的rNMR  以及應(yīng)用于GC-MS 儀器平臺的MetaQuant 、ADAP-GC  和TagFinder  等軟件， 即不同儀器平臺用于代謝產(chǎn)物的定量分析時，需要相應(yīng)的專用軟件支持。而且，像Agilent 公司的MassHunter 軟件，雖包含定量功能，但存在導(dǎo)出結(jié)果無法直接導(dǎo)入其他軟件以及操作較復(fù)雜等缺點。因此，如今對代謝物進行定量分析時，仍然主要采用基于峰強度信息的人工操作方式。鑒于此現(xiàn)狀，衛(wèi)潤民等基于Matlab 平臺，開發(fā)了一款適用于代謝產(chǎn)物批量定量的工具（batched metabolitequantification tool，BQT），且其已獲得軟件著作權(quán)（2011SR081319）。該軟件具有以下特點: 1）可對多個代謝物同時進行定量；2）支持Excel 格式文檔導(dǎo)入和導(dǎo)出；3）可提供對數(shù)變換以及缺失值填補等基本數(shù)據(jù)預(yù)處理功能。該軟件可使從儀器平臺的測試結(jié)果到數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析之間的定量過程自動化，使批量樣本的定量任務(wù)大大簡化，彌補了由人工操作帶來的缺陷和不便。

　　4 定量代謝組學(xué)的應(yīng)用

　　隨著代謝物定量研究的深入，代謝組學(xué)由定性或是半定量的非靶標研究向準確定量的靶標研究轉(zhuǎn)變。同時，定量代謝組學(xué)研究具有全面性及準確性等特點，可應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)各個領(lǐng)域，如疾病早期診斷、藥物作用機制、環(huán)境領(lǐng)域、毒理學(xué)研究、微生物領(lǐng)域以及植物學(xué)等。該部分簡要介紹在疾病早期診斷和藥物作用機制兩方面有關(guān)定量代謝組學(xué)的一些應(yīng)用。

　　4.1 用于疾病早期診斷

　　由于代謝組學(xué)處于生命信息傳遞鏈終端，故可體現(xiàn)生物體系整體狀態(tài)或功能的最終結(jié)果。一旦機體出現(xiàn)病理變化，其基礎(chǔ)代謝亦會發(fā)生相應(yīng)的改變，從而導(dǎo)致體內(nèi)小分子代謝物的濃度或種類發(fā)生改變，即代謝譜圖發(fā)生變化，而這種變化可能比臨床癥狀出現(xiàn)得更早。鑒于此，可借助定量代謝組學(xué)平臺，研究與疾病相關(guān)的生物標志物，對疾病進行早期診斷，預(yù)防疾病的進一步發(fā)展。目前，定量代謝組學(xué)已應(yīng)用于惡性腫瘤以及心血管和呼吸系統(tǒng)等的疾病早期診斷。吳澤明等采用LC-MS 方法，對黑膽質(zhì)證哮喘患者血清進行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)15 個與哮喘疾病相關(guān)的生物標志物，如在哮喘患者的血液中，硬脂酰胺含量升高，而溶血磷脂酰膽堿類物質(zhì)的含量降低。近期，有研究人員將蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合進行研究，同樣也發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者血液中，磷脂酰膽堿含量均上升，而溶血磷脂酰膽堿含量均降低。這為之前的研究提供了印證及補充，即磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿的含量變化特征是哮喘患者一種標志性的代謝模式，可作為診斷哮喘的一種輔助手段?？梢姡柚看x組學(xué)平臺，找出與疾病相關(guān)的生物標志物，并對其定量分析，可對疾病進行早期診斷，以防疾病繼續(xù)惡化發(fā)展。West 等采用UPLCMS/MS 法，對擴張型心肌?。―CM）模型小鼠心臟組織中與心臟代謝相關(guān)的130 多種代謝物進行定量測定，其中包括三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化、糖酵解以及氨基酸代謝等途徑的代謝產(chǎn)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DCM 模型小鼠心臟組織中，脯氨酸及甲基化組氨酸含量升高，提示肌纖維增加以及膠原蛋白降解；而且，一些三羧酸循環(huán)中間體以及肉毒堿衍生物含量下降，表明衰竭心臟其能量代謝下降。鑒于該方法可定量測定心血管疾病中一些關(guān)鍵代謝途徑，且覆蓋面廣，故借助該方法，可對心血管疾病進行評定與診斷。

　　4.2 用于藥物作用機制研究

　　中藥成分復(fù)雜，以中醫(yī)藥理論指導(dǎo)用藥的中成藥或中藥復(fù)方用于治療疾病的作用機制，一直未能得到國際上的認可，嚴重阻礙了中醫(yī)藥走出國門的步伐。而代謝組學(xué)位于生物系統(tǒng)信息傳遞鏈的終端，它能在代謝物水平上告訴我們自身機體已經(jīng)發(fā)生什么，即代謝組學(xué)可用于幫助人們理解病變過程和體內(nèi)物質(zhì)代謝途徑，也可根據(jù)某些指標水平變化來闡述藥物作用機制或功效，故代謝組學(xué)可成為一種解釋中藥作用機制的有效手段。鐘宏福等應(yīng)用定量代謝組學(xué)方法，研究天芪降糖膠囊（含黃芪、女貞子、人參、五倍子和黃連等）對糖耐量受損（IGT）患者體內(nèi)嘌呤嘧啶代謝的干預(yù)作用，其間，采用HPLC-二極管陣列檢測器（DAD）-MS-MS 法，對9 種嘌呤嘧啶類代謝物（潛在生物標志物）進行定量檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種代謝物（尿酸、黃嘌呤和肌酐）與糖尿病前期IGT 患者相關(guān)性較大，且尿酸與肌酐清除率呈負相關(guān)，其他6 種代謝物與正常組相比差異性較小。劉妍如采用基于NMR 和HPLC-MS/MS的定量代謝組學(xué)方法，研究貫葉連翹用于治療更年期綜合征的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，貫葉連翹主要通過調(diào)節(jié)肝臟代謝中精氨酸、鳥氨酸、蛋氨酸、?；撬?/a>、肉毒堿和三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物的水平，其次使膽堿和甜菜堿生成正常，從而改善脾臟的退行性變化，增強脾臟的抗炎作用，達到治療與炎癥效應(yīng)相關(guān)的更年期綜合征等疾病的效果。