艾滋病病毒很狡猾，它們會(huì)將自己的遺傳物質(zhì)整合至CD4+T細(xì)胞形成病毒庫，以休眠的狀態(tài)長(zhǎng)期存在于患者體內(nèi)。“永久性治愈”艾滋病需要解決潛伏的HIV。近期，來自于美國(guó)天普大學(xué)醫(yī)學(xué)院的胡文輝教授團(tuán)隊(duì)提出了新的思路：他們利用基因編輯技術(shù)成功“剔除”人源化小鼠多個(gè)器官中潛伏的HIV。

　　人類與艾滋病已經(jīng)斗爭(zhēng)了超30年，從最初的絕癥到現(xiàn)在的有效治療，艾滋病正朝著慢性疾病的方向慢慢轉(zhuǎn)變。但是，科學(xué)家們一直未曾放棄“治愈艾滋病”的夢(mèng)想，他們正在努力研發(fā)能夠治愈或者預(yù)防艾滋病的“良方”。

　　3月30日，Cell子刊《MolecularTherapy》在線發(fā)表了一篇題為“InVivoExcisionofHIV-1ProvirusbysaCas9andMultiplexSingle-GuideRNAsinAnimalModels”的文章，揭示了科學(xué)家們首次利用“魔剪”技術(shù)CRISPR有效剔除人源化小鼠多個(gè)器官中潛伏的人類艾滋病病毒。

　　“利用基因編輯治療艾滋病”的研究思路從何而來？該技術(shù)如何應(yīng)對(duì)HIV變異問題？它對(duì)于艾滋病治療將會(huì)產(chǎn)生怎樣的意義？帶著這些疑問，生物探索有幸采訪到這篇文章的最后通訊作者、美國(guó)天普大學(xué)醫(yī)學(xué)院的華人科學(xué)家——胡文輝教授。他表示：“這種‘導(dǎo)彈式靶向剔除潛伏病毒’的嘗試給以戰(zhàn)勝艾滋病為終點(diǎn)的科學(xué)研究帶來新的方向，它有望為徹底治愈艾滋病帶來希望。”

　　1實(shí)現(xiàn)“永久性治愈”？根源在于潛伏的HIV

　　“清除潛伏的HIV”——這是胡文輝教授自2008年在天普大學(xué)成立獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室以來一直試圖克服的難關(guān)。他表示：“艾滋病難以治愈的根源正是潛伏于人體內(nèi)細(xì)胞中的艾滋病病毒。”

　　根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球約有6000萬人感染艾滋病毒，其中2000萬人已死亡。近4000萬感染者，75%集中在15個(gè)國(guó)家，而中國(guó)位列其中。人類免疫缺陷病毒（HIV）入侵人體，主要通過攻擊T淋巴細(xì)胞瓦解免疫系統(tǒng)，致使患者免疫功能減弱，增加感染各種疾病或者發(fā)生惡性腫瘤的概率，進(jìn)而威脅生命。

　　慶幸的是，隨著核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的相繼問世，艾滋病不再是無藥可治的絕癥。“但是，轉(zhuǎn)變成慢性病的艾滋病依然面臨多種問題，包括藥物副作用、神經(jīng)損害、心血管損傷等等。”胡文輝教授強(qiáng)調(diào)，“在雞尾酒療法時(shí)代，仍有一半以上的艾滋病患者伴隨有不同程度的神經(jīng)認(rèn)知功能障礙，而且輕型神經(jīng)艾滋病（NeuroAIDS）患者數(shù)量正逐年增加。”

　　HIV作為逆轉(zhuǎn)錄病毒，變異性特別強(qiáng)。同時(shí)，它們通過將遺傳物質(zhì)永久性插入宿主細(xì)胞DNA中，形成病毒庫。一般情況下，這些潛伏的病毒處于休眠狀態(tài)，一旦脫離藥物抑制，它們便會(huì)重新猖獗。所以，治愈艾滋病必須跨過“潛伏病毒”這一難關(guān)。

　　近年來，科學(xué)家們提出了多種針對(duì)潛伏病毒的方法，包括“先激活后絕殺”（Shockandkill）、敲除病毒（Knockout）、永久性潛伏（Permanentsilencing）等等，他們希望通過實(shí)現(xiàn)從有效治療到徹底治愈的轉(zhuǎn)變，真正造福于患者。現(xiàn)在，胡文輝教授與同校同事KamelKhalili教授、美國(guó)匹茲堡大學(xué)楊文彬教授課題組合作，第一次在動(dòng)物模型上成功證實(shí)，利用基因編輯技術(shù)多靶點(diǎn)、高效剔除潛伏病毒的可行性。

　　2多篇文章，揭示“導(dǎo)彈式靶向剔除潛伏病毒”之旅

　　當(dāng)被問及“利用基因編輯治療艾滋病”這一研究思路的由來，胡文輝教授表示：“利用基因編輯技術(shù)敲除HIV是解決潛伏病毒的一個(gè)重要思路。在我們?cè)噲D應(yīng)用傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)、ZFN和TALEN基因編輯技術(shù)尚未成功之際，張峰團(tuán)隊(duì)開發(fā)出可編輯人類基因組的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，這給我們提供了一個(gè)很好的技術(shù)選擇。”借助于引導(dǎo)RNA（gRNA）和Cas9核酸酶的完美配合，這一“魔剪”技術(shù)能夠精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因位點(diǎn)的切割、編輯工作。

　　2014年，胡文輝教授課題組和KamelKhalili教授課題組合作，以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的潛伏有HIV病毒的人類細(xì)胞系為材料，首次成功利用CRISPR實(shí)現(xiàn)潛伏病毒的永久性清除，驗(yàn)證了最初的構(gòu)想。這一利用基因編輯技術(shù)將艾滋病病毒從人類基因組中剔除的文章在《PNAS》期刊一經(jīng)發(fā)表，就引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注。

　　隨后2年多，他們從體外試驗(yàn)轉(zhuǎn)向動(dòng)物試驗(yàn)，不斷優(yōu)化這一有望徹底治愈艾滋病的治療方案，并先后在《ScientificReport》、《AIDS》、《GeneTherapy》期刊發(fā)表研究成果。

　　這一篇最新發(fā)表在《MolecularTherapy》期刊的文章再一次揭示了有關(guān)靶向根治艾滋病的動(dòng)物試驗(yàn)的可行性和有效性。

　　首先，胡文輝教授帶領(lǐng)文章一作、博士后尹超然等課題組成員篩選和優(yōu)化了多個(gè)靶向剪接的腺相關(guān)病毒（AAV）的基因療法，在人類HIV轉(zhuǎn)基因小鼠成功獲得高效率剔除已經(jīng)整合的HIV基因組（DNA），且能夠顯著抑制（高達(dá)60-95%）多個(gè)器官組織中HIV的基因表達(dá)（RNA轉(zhuǎn)錄）。

　　隨后，胡文輝教授課題組與楊文彬教授課題組合作，使用改建的鼠類HIV病毒（EcoHIV）建立艾滋病小鼠急性感染模型。因?yàn)槿祟怘IV不能感染鼠類動(dòng)物，他們將帶有生物發(fā)光報(bào)告基因的EcoHIV病毒感染免疫缺陷裸鼠，同時(shí)給予HIV多靶點(diǎn)/saCas9的AAV-DJ8（人工合成的AAV血清型，綜合了8種自然AAV的血清型特性），然后用活體動(dòng)物生物發(fā)光圖像檢測(cè)儀（BLI）長(zhǎng)時(shí)間（19天）監(jiān)測(cè)動(dòng)物全身的EcoHIV動(dòng)態(tài)變化。他們首次證明多靶點(diǎn)基因編輯的AAV-DJ8基因療法能夠高效剔除鼠類HIV病毒（可達(dá)96%），并顯著減輕HIV急性感染。

　　最后，他們?cè)谌嗽椿∈驢IV模型上證明多靶點(diǎn)/saCas9的AAV-DJ8基因療法能有效剔除多個(gè)器官組織中的人類HIV潛伏感染病毒。他們用人類HIV活病毒感染人源化BLT小鼠(移植有人骨髓、肝和胸腺組織或細(xì)胞的免疫缺陷小鼠，其被艾滋病病毒感染和潛伏的方式與人類一致）建立HIV潛伏感染模型，給予HIV多靶點(diǎn)/saCas9的AAV-DJ8，2-4周后在多個(gè)器官組織中檢測(cè)到HIV基因組的成功切除。

　　圖示：腺相關(guān)病毒基因療法將多靶點(diǎn)基因編輯“魔剪”導(dǎo)入HIV感染小鼠體內(nèi)準(zhǔn)確剔除HIV病毒基因組，進(jìn)而抑制病毒轉(zhuǎn)錄和消除病毒復(fù)制。

　　3“巧妙應(yīng)對(duì)”HIV變異、脫靶、副作用等問題

　　為什么設(shè)計(jì)多個(gè)靶點(diǎn)？胡文輝教授表示有兩個(gè)原因：第一，在HIV轉(zhuǎn)錄區(qū)和結(jié)構(gòu)區(qū)設(shè)計(jì)了2-4個(gè)sgRNA實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)切除，這有利于顯著增加其剔除效率。第二，艾滋病病毒基因易于突變，應(yīng)用單靶點(diǎn)基因編輯有可能會(huì)出現(xiàn)病毒逃逸現(xiàn)象。他認(rèn)為：“多個(gè)有效靶點(diǎn)同時(shí)突變的可能性極小，即便某些個(gè)體患者出現(xiàn)突變，我們也可以快速重新設(shè)計(jì)和構(gòu)建相關(guān)的Cas9基因編輯系統(tǒng)。這正是Cas9基因編輯用于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)所在。”

　　針對(duì)CRISPR系統(tǒng)的脫靶問題，胡文輝教授告訴生物探索，他們?cè)缙诎l(fā)表的全基因組測(cè)序研究結(jié)果以及其它實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)。即使萬一單個(gè)靶點(diǎn)存在脫靶的可能，但是兩個(gè)或者多個(gè)脫靶點(diǎn)落在同一個(gè)正常功能性基因（僅占人類基因組的1.5%）的可能性微乎其微。

　　胡文輝教授強(qiáng)調(diào)，相比于目前的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，這一基于多靶點(diǎn)基因編輯的基因療法最大的優(yōu)勢(shì)之一在于安全。團(tuán)隊(duì)精心篩選的靶點(diǎn)sgRNA都是針對(duì)外源性病毒基因的，它們對(duì)宿主靶細(xì)胞的基因組具有高度特異性，從而確保了在剔除病毒過程中不干擾宿主細(xì)胞的存活和功能。他覺得，這種“只殺病毒不殺細(xì)胞”的效果至關(guān)重要。

　　4未來，還有哪些挑戰(zhàn)？

　　胡文輝教授表示：“目前，基因編輯療法尚不能100％清除動(dòng)物體內(nèi)的艾滋病病毒，但能夠顯著降低潛伏病毒量。”談及這一研究成果距離臨床試驗(yàn)的時(shí)間，胡文輝教授坦言，盡管目前最看好的AAV基因療法已經(jīng)在世界各地進(jìn)行臨床試用，但用于艾滋病病人還有很多挑戰(zhàn)和未知需要面對(duì)和解決：

　　第一，艾滋病治療效果的評(píng)估。目前，科學(xué)家們只是在活體動(dòng)物身上取得針對(duì)艾滋病的腺相關(guān)病毒基因療法的高效病毒剔除結(jié)果，相關(guān)的治療效果評(píng)估研究仍在進(jìn)行之中，尤其是更接近于HIV病人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物艾滋病模型，靶向剔除艾滋病病毒的可行性和有效性亟待測(cè)試。

　　第二，基因轉(zhuǎn)移效率難題。在多細(xì)胞、組織和器官水平，治療艾滋病和其它感染性疾病以及遺傳性疾病和癌癥的確切效果都取決于基因轉(zhuǎn)移效率。

　　第三，潛伏的宿主細(xì)胞。目前，國(guó)際公認(rèn)的HIV潛伏細(xì)胞包括T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞。而我們已有的腺相關(guān)病毒血清型是否足夠轉(zhuǎn)導(dǎo)所有的潛伏T細(xì)胞？另外，包括神經(jīng)干細(xì)胞在內(nèi)的其他細(xì)胞是否是尚未被發(fā)現(xiàn)的潛伏宿主細(xì)胞？

　　第四，CRISPR/Cas9技術(shù)自身的不斷完善。Cas核酸酶的不斷小型化和多元化？基因編輯的效率優(yōu)化和特異性優(yōu)化？

　　未來，能否找到靶向所有免疫細(xì)胞或者HIV潛伏細(xì)胞特異的基因療法？是否可以借助納米科技、類病毒顆粒優(yōu)化CRISPR系統(tǒng)？采訪最后，胡文輝教授暢談了很多新想法。他說：“對(duì)于基因治療艾滋病等疑難雜癥的應(yīng)用前景，我很有信心，也充滿期待。下一步，我們將繼續(xù)探索更有效、安全的基因療法和細(xì)胞療法。”