近年來(lái)，隨著對(duì)基因組學(xué)研究的逐漸深入，人們對(duì)腫瘤基因組的認(rèn)識(shí)逐漸加深；在此基礎(chǔ)上，隨著第二代測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，全基因組測(cè)序得以實(shí)現(xiàn)，各種新技術(shù)層出不窮。循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測(cè)就是其中重要的一員。該技術(shù)旨在通過(guò)檢測(cè)存在于患者血清中的腫瘤DNA，達(dá)到“無(wú)創(chuàng)活檢”的目的，在腫瘤早期疾病篩查、評(píng)估疾病進(jìn)展、術(shù)后監(jiān)測(cè)隨訪等方面具有巨大的臨床應(yīng)用潛能。作為一個(gè)血清學(xué)標(biāo)志物，它具有無(wú)創(chuàng)、精準(zhǔn)的特性，目前在惡性腫瘤、良性疾病和產(chǎn)前檢查領(lǐng)域中均有研究。

循環(huán)腫瘤DNA

早在1948年，Mandel和Métais就在人類的血液中發(fā)現(xiàn)了獨(dú)立于細(xì)胞之外的游離DNA（cfDNA）。1977年，S.A.Leon等通過(guò)放射免疫分析的方法，發(fā)現(xiàn)血清cfDNA水平與腫瘤的相關(guān)性。他們以125I標(biāo)記DNA，檢測(cè)血清中的cfDNA，分別觀察173例不同腫瘤患者和55例健康對(duì)照后發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者體內(nèi)cfDNA水平顯著升高；而接受放射治療后，部分患者體內(nèi)cfDNA水平顯著降低，其水平與腫瘤大小、患者疼痛指數(shù)有相關(guān)性。該研究為此后ctDNA與腫瘤之間相關(guān)研究奠定了基石。

ctDNA的定義為循環(huán)血液中所存在的腫瘤DNA片段。與cfDNA不同，ctDNA強(qiáng)調(diào)與腫瘤的相關(guān)性，即它來(lái)自腫瘤，且片段中含有腫瘤特異性的突變。健康人血液中存在cfDNA，但是一定沒(méi)有ctDNA；惡性腫瘤患者cfDNA載量明顯上升，其中大部分均為來(lái)自腫瘤釋放的ctDNA。其次二者檢測(cè)手段不同，cfDNA可以以一段穩(wěn)定的體細(xì)胞序列為探針，但ctDNA檢測(cè)必須運(yùn)用腫瘤特異性突變做探針。限于目前對(duì)腫瘤基因組的認(rèn)識(shí)不足，因此許多研究中使用cfDNA的水平替代ctDNA來(lái)檢測(cè)惡性腫瘤。

腫瘤患者血液中的循環(huán)DNA帶有腫瘤相關(guān)的基因和表觀基因型突變，這些突變與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和耐藥性相關(guān)。突變類型包括雜合性缺失、抑癌基因突變（如tp53基因）及原癌基因突變（如kras和braf基因）。其中kras基因突變見(jiàn)于10%~30%的子宮內(nèi)膜癌患者。p53基因突變也常見(jiàn)于子宮內(nèi)膜癌中，甚至與患者的預(yù)后有一定相關(guān)性。此外子宮內(nèi)膜癌中常伴有表觀遺傳學(xué)的改變，如甲基化異常。這些突變位點(diǎn)作為檢測(cè)靶點(diǎn)，是ctDNA檢測(cè)的基礎(chǔ)。cfDNA由基因組DNA和線粒體DNA構(gòu)成。同樣包含編碼DNA和非編碼DNA，其中非編碼DNA可以用來(lái)檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定、雜合性缺失、基因多態(tài)性、完整性等異常改變。

循環(huán)DNA的產(chǎn)生機(jī)制不甚明確，目前有許多假說(shuō)與猜測(cè)。研究者推測(cè)血液中游離的核酸來(lái)自壞死和凋亡的腫瘤細(xì)胞。此外，ctDNA也可能來(lái)自于癌細(xì)胞的主動(dòng)分泌。據(jù)估計(jì)，若腫瘤組織超過(guò)100g，則每天將會(huì)有約3.3%的腫瘤DNA釋放入血液。DNA碎片的大小介于70~200個(gè)堿基對(duì)不等，大者可達(dá)21kb。循環(huán)中腫瘤細(xì)胞或已轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移細(xì)胞也可能是ctDNA的來(lái)源之一。

腫瘤具有異質(zhì)性，一塊腫瘤組織所含細(xì)胞的基因組不盡相同。腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤相關(guān)性的ctDNA和野生型（正常）cfDNA同時(shí)會(huì)被釋放入血，因此盡管來(lái)源于同一塊腫瘤組織的cfDNA其成分也千差萬(wàn)別。cfDNA的血清水平同樣受到清除率、降解率和其他血液系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)的濾過(guò)影響。核酸通過(guò)肝臟和腎臟代謝，其半衰期在15min~420min之間。值得注意的是，血清中ctDNA載量上升可見(jiàn)于多種狀況，除惡性腫瘤之外，良性腫瘤、炎癥、中風(fēng)、創(chuàng)傷、膿毒血癥等應(yīng)激狀況下也會(huì)上升，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)注意鑒別。

ctDNA檢測(cè)與液體活檢

液體活檢指通過(guò)采集患者體液，包括血液及唾液、汗液等分泌物，進(jìn)行無(wú)創(chuàng)的腫瘤檢測(cè)的方法。目前常見(jiàn)的檢測(cè)項(xiàng)目包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞、ctDNA、循環(huán)腫瘤mRNA及腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體等。它們共同的特點(diǎn)是需要經(jīng)過(guò)采集體液、富集、通過(guò)特異性探針捕獲細(xì)胞/DNA/mRNA/外泌體、定量檢測(cè)的過(guò)程。ctDNA的檢測(cè)目前缺乏一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的手段，目前最常見(jiàn)的檢測(cè)方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），具體又分為實(shí)時(shí)定量PCR、數(shù)字PCR等方法。但是整個(gè)檢測(cè)流程，包括采血、處理、標(biāo)本儲(chǔ)存、制定正常值等問(wèn)題都亟待規(guī)范。目前ctDNA檢測(cè)尚處試驗(yàn)探索階段，不同研究應(yīng)用不同的平臺(tái)和方法，為試驗(yàn)結(jié)果的解讀和比較帶來(lái)了困難。

ctDNA與子宮內(nèi)膜癌

理論上ctDNA檢測(cè)是一項(xiàng)精準(zhǔn)技術(shù)，具有良好的發(fā)展前景，但由于目前腫瘤基因組的認(rèn)識(shí)不足以及檢測(cè)手段的局限性，同樣關(guān)于子宮內(nèi)膜癌的研究結(jié)果亦不盡人意。Tanaka等人比較了子宮內(nèi)膜癌患者與良性疾病及健康對(duì)照的血清cfDNA水平差異。共納入53例子宮內(nèi)膜癌患者，9例良性婦科疾病患者和15例健康對(duì)照。結(jié)果表明子宮內(nèi)膜癌患者cfDNA定量略高于良性病變患者，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；患者術(shù)前和術(shù)后相比較，cfDNA水平差別也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該研究表明ctDNA定量在子宮內(nèi)膜癌篩查中的應(yīng)用具有局限性，作者推測(cè)同一患者不同時(shí)間點(diǎn)cfDNA水平的變化可能具有意義。Dobrzycka等人進(jìn)行了一項(xiàng)研究，共納入109例初診子宮內(nèi)膜癌患者，結(jié)果20例（18%）患者血中檢出cfDNA，其中Ⅱ型內(nèi)膜癌患者檢出率較高，可達(dá)36.4%（8/22）；而I型內(nèi)膜癌中檢出率僅為13.8%（12/87）。作者因此認(rèn)為cfDNA有作為Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌獨(dú)立血清預(yù)后因子的潛力，其聯(lián)合p53-Ab診斷子宮內(nèi)膜癌甚至指導(dǎo)治療。Pereira等人對(duì)子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌患者血清中的ctDNA進(jìn)行較為全面的研究。共納入卵巢癌22例，子宮內(nèi)膜癌17例。結(jié)果提示，ctDNA對(duì)于子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌診斷的敏感性與CA125相似，但是特異性非常高，因此在特異性方面優(yōu)于CA125。對(duì)比手術(shù)前后ctDNA的水平，研究者觀察到術(shù)后ctDNA的消失與患者預(yù)后顯著相關(guān)。

綜合以上文獻(xiàn)，目前認(rèn)為循環(huán)腫瘤DNA的檢測(cè)并不適用于子宮內(nèi)膜癌的早期篩查。值得一提的是，Dobrzycka等的研究提示我們ctDNA可能對(duì)Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌敏感性更強(qiáng)。這類特殊類型的子宮內(nèi)膜癌，如漿液性癌，其侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，早期即可發(fā)生盆腹腔轉(zhuǎn)移，若能通過(guò)ctDNA篩查，則臨床意義更大。子宮內(nèi)膜癌患者血清中同樣存在有異常甲基化DNA片段，可以作為檢測(cè)靶點(diǎn)，甲基化的異常在其他婦科腫瘤中均有研究，但是子宮內(nèi)膜癌相關(guān)研究甚少。究其原因，一方面由于子宮內(nèi)膜癌早期癥狀明確，健康人群無(wú)需進(jìn)行常規(guī)篩查；另一方面通過(guò)宮腔灌洗液或子宮內(nèi)膜活檢的方法可以簡(jiǎn)單、方便地獲得細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，對(duì)組織學(xué)標(biāo)本DNA檢測(cè)較血清或血漿更為精確。

展望

ctDNA檢測(cè)僅通過(guò)采集患者外周血，即可獲得體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的基因組信息，是一種突破性的革新技術(shù)。相較于傳統(tǒng)的內(nèi)膜活檢具有以下獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)：（1）無(wú)創(chuàng)，避免了傳統(tǒng)方法為患者帶來(lái)的不適；（2）取樣全面，一次性采集體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的全部信息，避免腫瘤異質(zhì)性帶來(lái)的取樣不全；（3）精準(zhǔn)，直接獲得腫瘤基因組信息，同時(shí)用于指導(dǎo)后續(xù)靶向治療；（4）早期即可在血中檢出，甚至早于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)；（5）腫瘤分子分型是一種趨勢(shì)，最新的分型方法基于突變類型和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，將傳統(tǒng)的二分類法擴(kuò)充為四類，而傳統(tǒng)的CA125、影像學(xué)檢查結(jié)果對(duì)新的分型沒(méi)有意義。未來(lái)我們可能必須要獲得腫瘤基因組信息才能開啟一系列精準(zhǔn)治療方案，此時(shí)ctDNA檢測(cè)可能會(huì)成為診療過(guò)程中不可缺少的一部分。

盡管前景光明，但是ctDNA檢測(cè)作為一種新興技術(shù)，仍存有許多問(wèn)題。首先這項(xiàng)技術(shù)只停留在實(shí)驗(yàn)階段，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。如對(duì)于血樣采集、DNA分離、檢測(cè)手段等，不同試驗(yàn)研究中異質(zhì)性非常大。其次，腫瘤的異質(zhì)性決定了其基因突變位點(diǎn)多而復(fù)雜，如何確定最優(yōu)的候選基因需要研究者們的大量的工作。最后，目前對(duì)于ctDNA的檢測(cè)手段仍不完善，組織學(xué)與血液學(xué)結(jié)果存在差異。因此短期內(nèi)想要在臨床中實(shí)現(xiàn)十分困難。

總之，ctDNA液體活檢技術(shù)在子宮內(nèi)膜癌中具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)和很好的應(yīng)用前景。盡管目前的應(yīng)用較為局限，但是相信隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，會(huì)有更多新的檢測(cè)項(xiàng)目和手段被提出，其獨(dú)特的臨床價(jià)值會(huì)逐漸顯現(xiàn)。