近視是世界上導(dǎo)致視力下降最主要的原因。隨著過去20年近視發(fā)病率的不斷增高，目前它已成為一個(gè)主要的公共健康問題。在2000年，有14.06億人是近視眼（占世界人口的22.9%），其中高度近視的有1.63億人（占世界人口的2.7%）。預(yù)計(jì)到2050年，近視人群將達(dá)到世界人口的49.8%，高度近視將達(dá)到9.8%。盡管近視可以通過框架眼鏡等進(jìn)行屈光矯正，但是它會(huì)明顯增加其他致盲性眼病的風(fēng)險(xiǎn)，比如近視性黃斑病變，視網(wǎng)膜脫離，青光眼，白內(nèi)障等。雖然增加戶外活動(dòng)時(shí)間，使用OK鏡以及局部阿托品等方法對(duì)于近視進(jìn)展有延緩作用，但是由于他們的作用機(jī)制以及近視的發(fā)病機(jī)制不明，因此效果有限。因此迫切需要一個(gè)能更好解釋近視發(fā)病的理論，且能發(fā)展安全有效的治療措施。

近視的發(fā)展與眼軸的過度增長(zhǎng)有關(guān)，在近視的動(dòng)物模型和人類中，這種改變常常伴隨著鞏膜的變薄，而鞏膜正是能維持眼球形狀和完整的重要組織。在不同近視模型中的鞏膜改變，促進(jìn)了鞏膜在近視發(fā)展中潛在機(jī)制的研究。這些研究已經(jīng)表明近視相關(guān)的鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重塑與ECM成分的合成減慢和分解加速有關(guān)。因此破壞了鞏膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致眼軸的增長(zhǎng)?？扇绾我疬@些改變的機(jī)制仍舊不明，其中的關(guān)鍵性問題是近視相關(guān)的鞏膜ECM重塑是如何被誘發(fā)的。一種假設(shè)是視網(wǎng)膜的視覺信號(hào)產(chǎn)生一種我們未知的分子，并在脈絡(luò)膜中啟動(dòng)反應(yīng)。緊接著脈絡(luò)膜產(chǎn)生信號(hào)并傳遞到鞏膜并誘導(dǎo)ECM的重塑。

哺乳動(dòng)物的鞏膜是由單一的纖維層組織組成，包含有各類異質(zhì)的細(xì)胞群，如成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，以及巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。但是既往由于實(shí)驗(yàn)的難度，很難將這些不同的鞏膜細(xì)胞分離開并對(duì)他們進(jìn)行特異性的分析。因此到目前為止，研究者都是將鞏膜組織進(jìn)行整體研究。但是這種方法就限制了研究者在鞏膜誘導(dǎo)近視發(fā)展中發(fā)現(xiàn)局部和細(xì)胞特異性的信號(hào)分子的改變。而單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)能很好的解決視網(wǎng)膜中存在不同細(xì)胞類型的復(fù)雜問題。因此在本研究中，研究者就利用了單細(xì)胞RNA測(cè)序的技術(shù)，來檢測(cè)鞏膜組織中不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)情況，是如何導(dǎo)致細(xì)胞的表型改變的（成纖維細(xì)胞到肌成纖維細(xì)胞），以及在近視發(fā)展中鞏膜的ECM的變化。研究結(jié)果發(fā)表在PNAS雜志上。

首先從行覺剝奪（近視模型）和對(duì)側(cè)眼正常的小鼠眼球的鞏膜中分離出93個(gè)單細(xì)胞，并對(duì)他們進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的分析，在剔除掉22個(gè)的細(xì)胞后，剩余的71個(gè)細(xì)胞均表達(dá)成纖維細(xì)胞的標(biāo)記基因（Vim,Col1a1,Col1a2,S100a4,Acta2,Postn,Fap,Ddr2）（圖1A）。通過計(jì)算71個(gè)鞏膜成纖維細(xì)胞每個(gè)基因表達(dá)水平的平方變異系數(shù)（CV2），我們確定了4463個(gè)基因在表達(dá)上具有異質(zhì)性（圖1B）。將這些基因進(jìn)行層次聚類分析（圖1C），可以將這71個(gè)細(xì)胞分類成2種主要的類型，可以稱為A1和A2，分別包含20個(gè)和51個(gè)細(xì)胞。雖然A1和A2兩種纖維細(xì)胞類型均存在于行覺剝奪和正常的眼中，但是A2細(xì)胞的比例在行覺剝奪的眼中明顯高于正常眼（圖1D）。通過成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的高低，可以定義A1細(xì)胞為靜止的成纖維細(xì)胞（成纖維樣細(xì)胞），A2細(xì)胞為肌成纖維細(xì)胞或者是由成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞過程中的中間狀態(tài)的細(xì)胞（肌成纖維樣細(xì)胞）。從成纖維樣細(xì)胞到肌成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)現(xiàn)有660個(gè)基因具有明顯的改變（P<0.05,TPM>2或者<0.5）。通路分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因明顯聚集于26條通路中，且其中有9條通路顯示出顯著的預(yù)測(cè)活性模式（圖2A）。最頂端的富集通路分別是eIF2信號(hào)，mTOR信號(hào)和心血管系統(tǒng)中的缺氧信號(hào)通路，這些信號(hào)通路均對(duì)缺氧起調(diào)節(jié)反應(yīng)，這些改變提示這些缺氧相關(guān)的信號(hào)通路可能在行覺剝奪的眼中被激活。為了證明由單細(xì)胞RNA測(cè)序分析得到的相關(guān)信號(hào)通路的作用，研究者在行覺剝奪的小鼠上用RT-PCR來檢測(cè)3條通路中8個(gè)差異表達(dá)基因的mRNA表達(dá)水平。與單細(xì)胞RNA測(cè)序的結(jié)果一致，這8個(gè)基因的mRNA表達(dá)在行覺剝奪小鼠的鞏膜中明顯升高，但是也發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜中的表達(dá)沒有改變。這些結(jié)果均證明鞏膜成纖維細(xì)胞中的eIF2，mTOR和缺氧信號(hào)通路均與近視的發(fā)展相關(guān)。

圖1.A.確定細(xì)胞類型的標(biāo)記物的表達(dá)B.紅線代表基因的平均表達(dá)水平，粉紅點(diǎn)代表差異基因的CV2低于觀察值C.根據(jù)TPM將71個(gè)鞏膜細(xì)胞進(jìn)行層次聚類分析，X軸代表差異基因，Y軸代表鞏膜細(xì)胞，其中粉色為行覺剝奪眼，藍(lán)色為正常眼D.A1和A2細(xì)胞在正常眼和行覺剝奪眼中的比例，A2細(xì)胞在行覺剝奪眼和正常眼占的的比例分別為85.7%和58.3%（P=0.021）。

為了找到細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵分子，研究者又根據(jù)分層聚類的結(jié)果將肌成纖維樣細(xì)胞分成4個(gè)亞組（圖2B）。通過分析及相關(guān)性最后發(fā)現(xiàn)HIF-1α在成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的過程中起關(guān)鍵作用（圖2C）。然后利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)來研究近視相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因與信號(hào)通路的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HIF-1α分別與近1/3（45/145）的近視風(fēng)險(xiǎn)基因相關(guān)，10個(gè)（10/27）病理性近視相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因相關(guān)（圖2D）。

圖2.A.通路分析P<0.01且絕對(duì)激活分值>2的通路，除了PPAR/RXRα是被抑制，其余通路在A2細(xì)胞中均被激活B.A2亞群細(xì)胞的聚類分析C.不同細(xì)胞和亞組細(xì)胞的Hif1a表達(dá)D.人類病理性近視相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因與HIF-1α信號(hào)通路的關(guān)系

為了證明鞏膜缺氧是近視的一個(gè)特征，在行覺剝奪2天和2周的小鼠，用Westernblot檢測(cè)鞏膜中HIF-1α的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，但是在視網(wǎng)膜中卻沒有差異。并且在行覺剝奪2周后，小鼠眼軸變長(zhǎng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，在行覺剝奪和負(fù)透鏡誘導(dǎo)2天和1周的豚鼠近視模型中，發(fā)現(xiàn)鞏膜中HIF-1α的表達(dá)明顯升高，而在去除誘導(dǎo)因素2天后，表達(dá)水平也恢復(fù)正常，而視網(wǎng)膜中的表達(dá)始終未發(fā)現(xiàn)變化。繼續(xù)探索鞏膜缺氧在近視中的作用，研究者在體外將人類鞏膜成纖維細(xì)胞暴露在缺氧的環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白及肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白表達(dá)增加，成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白表達(dá)減少，表明缺氧可能是通過鞏膜肌成纖維細(xì)胞的分化來影響近視發(fā)展的。

而在行覺剝奪的豚鼠眼周注射抗缺氧的藥物（紅景天和芒柄花素）4周，發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)上調(diào)明顯被抑制，COL1α1的表達(dá)下調(diào)也被抑制，而α-SMA的表達(dá)沒有差別（圖3A和B）。更為重要的是，連續(xù)4周注射紅景天高劑量組（10ug/每天）比低劑量組（1ug/每天）控制近視進(jìn)展的效果更好（圖3C），眼軸的和玻璃體的長(zhǎng)度也更短（圖3D和E）。而連續(xù)4周注射芒柄花素高劑量組（5ug/每天）與低劑量組（0.5ug/每天）相比沒有差別，但與空白組相比明顯控制近視進(jìn)展（圖3F）,眼軸和玻璃體的長(zhǎng)度兩組也沒有差別，但也都明顯短于空白組（圖3G和H）。相反，在正常的豚鼠中注射紅景天和芒柄花素并不會(huì)引起屈光，眼軸和玻璃體長(zhǎng)度的任何改變。同時(shí)研究者也發(fā)現(xiàn)在注射抗氧化藥物后，行覺剝奪豚鼠的eIF2α和mTOR的磷酸化水平降低，而通過注射eIF2α和mTOR磷酸化抑制劑，可以控制行覺剝奪小鼠的近視進(jìn)展，這些結(jié)果都證明了缺氧相關(guān)的信號(hào)通路在近視發(fā)展中的作用。

圖3.A.在正常眼和行覺剝奪眼注射紅景天，行覺剝奪眼HIF-1α的表達(dá)上調(diào)明顯被抑制，COL1α1的表達(dá)下調(diào)被抑制，而α-SMA的表達(dá)沒有差別;正常眼均沒有差別B.在正常眼和行覺剝奪眼注射芒柄花素，行覺剝奪眼HIF-1α的表達(dá)上調(diào)明顯被抑制，COL1α1的表達(dá)下調(diào)被抑制，而α-SMA的表達(dá)沒有差別；正常眼均沒有差別C.注射紅景天高劑量組比低劑量組控制近視進(jìn)展效果更好D,E.射紅景天高劑量組比低劑量組眼軸和玻璃體長(zhǎng)度更短F.注射芒柄花素高劑量組與低劑量組相比控制近視進(jìn)展沒有差別，但與空白組相比有明顯差別G,H:注射芒柄花素高劑量組與低劑量組相比眼軸和玻璃體的長(zhǎng)度沒有差別，但也都明顯短于空白組

綜上研究結(jié)果，研究者提出近視相關(guān)的視覺信號(hào)可以造成脈絡(luò)膜毛細(xì)血管和血流的降低，導(dǎo)致對(duì)周圍無血管鞏膜的氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分供給減少，鞏膜缺氧由此出現(xiàn)，隨之HIF-1α的表達(dá)上調(diào)，eIF2α和mTOR的磷酸化水平增高，并促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和膠原蛋白的減少，這些導(dǎo)致鞏膜ECM的重塑，使得鞏膜變得薄弱，最終導(dǎo)致眼軸增長(zhǎng)和近視的發(fā)展（圖4）。當(dāng)然還需要更多的實(shí)驗(yàn)來證明脈絡(luò)膜與鞏膜間相互作用的詳細(xì)機(jī)制。

該項(xiàng)研究不僅為我們提供了一個(gè)理解近視發(fā)病機(jī)制的概念，也為我們提出了可以控制近視進(jìn)展的可行方法。

參考文獻(xiàn)：WuH,ChenW,ZhaoF,etal.Scleralhypoxiaisatargetformyopiacontrol.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.2018;115:E7091-E7100

短評(píng)：

毋庸置疑，近視已經(jīng)成為一個(gè)全球性公共健康問題，不僅因?yàn)槠浒l(fā)病率增長(zhǎng)，程度加重以及發(fā)病年齡提前的顯著性趨勢(shì)，更因?yàn)榫湍壳岸?，在多種高發(fā)疾病逐漸被關(guān)注、被成功防治的先進(jìn)醫(yī)療環(huán)境下，針對(duì)近視的預(yù)防和治療在大部分時(shí)候仍是汲深綆短，而造成這一現(xiàn)狀的主要原因則是對(duì)近視發(fā)病機(jī)制的不清楚，不理解，和不深入。本研究從鞏膜缺氧作為著眼點(diǎn)，成功指出鞏膜缺氧對(duì)近視的促發(fā)作用，因此進(jìn)一步解釋了近視發(fā)生時(shí)ECM的薄弱和病態(tài)重塑，使抑制和治療鞏膜缺氧有望成為近視防控的重要突破點(diǎn)，具有深遠(yuǎn)的基礎(chǔ)和臨床意義。