在廣州九龍鎮(zhèn)有一座“豬賓館”，生活著一群身嬌肉貴的實(shí)驗(yàn)小豬，他們能精準(zhǔn)地模擬人類的疾病?？茖W(xué)家利用基因“剪刀”CRISPR-Cas9，精準(zhǔn)地把人突變的亨廷頓基因“粘貼（敲入）”到豬的亨廷頓基因中，從而使豬得了亨廷頓舞蹈病。
廣東科學(xué)家領(lǐng)銜的國際研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過四年努力，首次利用基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9）和體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬，精準(zhǔn)地模擬出人類神經(jīng)退行性疾病。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地“豬豬賓館”
該項(xiàng)成果于北京時(shí)間3月30日在線發(fā)表在生物學(xué)頂尖學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》上，該研究為開發(fā)治療亨廷頓舞蹈病的新手段提供了穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型，也為培育其它神經(jīng)退行性疾病大動(dòng)物模型提供了技術(shù)范本和理論依據(jù)。研究將推動(dòng)我國發(fā)展出大動(dòng)物疾病模型的
醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，也可用于
干細(xì)胞治療等手段的臨床前評價(jià)，最終造福于人類。
“近年來，我國在基因編輯猴和克隆猴的研究中相繼取得突破性成果。”中科院院士裴鋼教授在得知該成果發(fā)表后指出，此次我國科學(xué)家在豬的疾病模型研究中又取得重大進(jìn)展，表明我國在大動(dòng)物模型的研究中已走在世界前列，將極大地推動(dòng)我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展。
該成果由暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院教授李曉江團(tuán)隊(duì)、中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院研究員賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)、美國埃默里大學(xué)教授李世華團(tuán)隊(duì)等多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)共同完成，論文共同通訊作者為李曉江、賴良學(xué)、李世華，論文共同第一作者為暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院副研究員閆森和涂著池博士、中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院劉朝明。
什么是亨廷頓舞蹈癥
亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等是當(dāng)今社會嚴(yán)重威脅人類健康的神經(jīng)退行性疾病。這些疾病伴隨年齡漸長而產(chǎn)生、可
遺傳、呈漸進(jìn)性發(fā)展，由于缺乏合適的動(dòng)物模型進(jìn)行藥物篩選，目前尚無有效的治療方法。
李曉江介紹，神經(jīng)退行性疾病是致病蛋白變異后沉淀在神經(jīng)細(xì)胞中，造成神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，并引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。而亨廷頓舞蹈病是由單基因（HTT）突變導(dǎo)致的神經(jīng)退性疾病。這是一個(gè)理想的疾病模式，可用于研究蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊如何引起選擇性的神經(jīng)退性病變，是以后研究多基因突變病癥的基礎(chǔ)。
尋找合適的疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/strong>
小鼠作為最常見的動(dòng)物模型，已被廣泛地用于研究人類疾病機(jī)理和尋找臨床治療方法。李曉江團(tuán)隊(duì)在研究中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)突變基因的神經(jīng)退行性疾病小鼠模型，并不能表現(xiàn)出像病人腦中一樣的典型神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要病理特征。許多有治療效果的藥物在小鼠模型中有效，在臨床上對病人往往無效。為了探索動(dòng)物模型，他開始把目光轉(zhuǎn)移到大動(dòng)物、非人靈長類動(dòng)物身上。
早在2008年，“夫妻檔”科學(xué)家李曉江、李世華在美國Emory大學(xué)合作者的支持下，通過將外源性的突變基因引入到獼猴的體內(nèi)，成功地建立了世界首只轉(zhuǎn)基因亨廷頓病猴模型。李曉江說，在該模型中，可以明顯地觀察到相應(yīng)的病理特征和行為變化，但表達(dá)外源性致病基因片段的毒性過強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)基因猴子基本在出生后較短時(shí)間內(nèi)死亡，同時(shí)無法傳代。因此，轉(zhuǎn)基因亨廷頓病猴模型無法達(dá)到篩選治療疾病的藥物的目的。
為何選擇豬
位于廣州九龍鎮(zhèn)的“豬賓館”，記者看到，科學(xué)家們正精心飼養(yǎng)著一群身價(jià)不菲的實(shí)驗(yàn)小豬。與果蠅、線蟲、小鼠等小型動(dòng)物相比，豬被公認(rèn)為是人類醫(yī)學(xué)研究理想的大動(dòng)物模型。賴良學(xué)解釋，豬的心血管系統(tǒng)、
消化系統(tǒng)、皮膚、營養(yǎng)需要、骨骼
發(fā)育以及礦物質(zhì)代謝等都與人的情況極其相似，豬的體型大小和馴服習(xí)性允許進(jìn)行反復(fù)采樣和進(jìn)行各種外科手術(shù)。
賴良學(xué)提到，與非人靈長類動(dòng)物相比，豬的基因多樣、繁殖周期短、一窩產(chǎn)仔多，便于根據(jù)特殊需要進(jìn)行選育，又不存在倫理學(xué)方面的問題。所以，豬的疾病模型用于做藥物篩選、人類疾病研究、干細(xì)胞治療的研究結(jié)果，更容易轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。
作為華南地區(qū)重要的大動(dòng)物疾病模型實(shí)驗(yàn)平臺之一，賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)先后建立了20余種在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要價(jià)值的轉(zhuǎn)基因和基因打靶克隆豬。2010年，這對“夫妻檔”找到了賴良學(xué)，一拍即合，他們合作建立了首例轉(zhuǎn)基因亨廷頓病豬模型。
“世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬模型，在模擬病人的神經(jīng)病理變化特別是腦疾病方面，大動(dòng)物模型比小動(dòng)物模型更具優(yōu)勢。”賴良學(xué)接受《中國科學(xué)報(bào)》記者采訪時(shí)表示，該研究為開發(fā)治療亨廷頓舞蹈病的新手段提供了穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型，也為培育其它神經(jīng)退行性疾病大動(dòng)物模型提供了技術(shù)范本和理論依據(jù)。
大膽的科學(xué)設(shè)想
擺在科學(xué)家面前的是一個(gè)難題，與轉(zhuǎn)基因亨廷頓病猴模型一樣，豬模型也具有明顯的表型特征，但不易存活，無法傳代。這一問題，曾一度令他們感到非常困擾。李世華說，“人是在某個(gè)定點(diǎn)基因突變而導(dǎo)致亨廷頓疾病，而目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)是隨機(jī)性的將外來的變異基因插入動(dòng)物的基因組，其表達(dá)量也高于內(nèi)源性致病基因。”
團(tuán)隊(duì)進(jìn)而分析，直接把豬的內(nèi)源性基因改變?yōu)橥蛔兓颍i的病理變化應(yīng)該與病人的病理狀態(tài)更接近。然而，基因敲入的效率太低，在大動(dòng)物中很難獲得。2013年，隨著基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9）被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物中，在廣東省科技計(jì)劃的支持下，他們大膽嘗試這一科學(xué)設(shè)想，李世華著手應(yīng)用Cas9技術(shù)來建立亨廷頓基因敲入豬模型。團(tuán)隊(duì)通力合作，利用基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9），將人突變的亨廷頓基因插入到豬的內(nèi)源性亨廷頓基因的表達(dá)框中，即人外顯子1中包含150CAG重復(fù)序列精確地插入豬的HTT內(nèi)源性基因中。
能夠成功關(guān)鍵還看實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，利用成纖維細(xì)胞篩選出陽性克隆細(xì)胞，這并非一件易事，“單細(xì)胞逐個(gè)挑出來并進(jìn)行篩選及鑒定，一定要挑選狀態(tài)最好的細(xì)胞用來胚胎移植”。負(fù)責(zé)此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)工作的閆森先后篩選了上千個(gè)細(xì)胞，從中挑出確定帶有突變基因且狀態(tài)最好的細(xì)胞，閆森說，“每天早上7點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞間，看細(xì)胞、換液、不停地跟細(xì)胞打交道，一抬頭已是下午3點(diǎn)。好不容易篩選到的陽性克隆細(xì)胞如果狀態(tài)不好又得重來，只有大量篩選才能獲得最優(yōu)的細(xì)胞克隆。很快，實(shí)驗(yàn)進(jìn)入下一步，他們運(yùn)用體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行克隆，成功培育帶有突變基因的新生豬。
在歷經(jīng)5個(gè)月的觀察后，亨廷頓豬出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)障礙等漸進(jìn)性發(fā)病的表型。下一步就是將穩(wěn)定表達(dá)的基因敲入亨廷頓豬繁殖下去。由于疾病模型豬身體狀態(tài)不好，在傳代過程中更需要悉心的照料。終于在團(tuán)隊(duì)的呵護(hù)下F1代小豬出生了。為了證明亨廷頓基因敲入豬的病理特征更接近于人類。李世華多次從美國返回國內(nèi)親自指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，到豬場看小豬的生存環(huán)境及生活狀態(tài)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果傳來，他們成功了！其結(jié)果驗(yàn)證，該模型不但能夠模擬亨廷頓病患者在大腦紋狀體的神經(jīng)元選擇性死亡的典型病理特征，在行為上也表現(xiàn)出類似亨廷頓病“舞蹈樣”的異常行為。難能可貴的是，這些病理及行為學(xué)表型都可以穩(wěn)定地遺傳給后代。
作為世界首例亨廷頓病豬基因敲入模型，它表明在模擬病人的神經(jīng)病理變化特別是腦疾病方面，大動(dòng)物模型比小動(dòng)物模型更具優(yōu)勢。
為人類試藥造福于人類
神經(jīng)疾病基因敲入豬的成功，將推動(dòng)我國發(fā)展出大動(dòng)物疾病模型的醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)針對阿爾茨海默病、帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進(jìn)程。同時(shí)，該動(dòng)物模型可用于干細(xì)胞治療等手段的臨床前評價(jià)，最終造福于人類。
從事多年研究亨廷頓病的權(quán)威專家、美國加州大學(xué)洛杉磯分校楊向東(X.WilliamYang)教授指出，亨廷頓舞蹈病基因敲入豬的建立是神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域中一個(gè)里程碑式的發(fā)現(xiàn)，使科學(xué)家能更深入了解神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)制及尋找有效的治療方法。
文章共同第一作者為暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院閆森副研究員和涂著池博士、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院劉朝明。中山大學(xué)、吉林大學(xué)、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)的科學(xué)家們也參與了該工作。研究工作得到了國家自然科學(xué)基金委、國家重大研究計(jì)劃、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃以及廣東省科技計(jì)劃的大力支持。
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