走進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)代謝副產(chǎn)物 - NH4+

2018-04-13 來源：藥渡標(biāo)簽：掌上醫(yī)生喝茶減肥一天瘦一斤安全減肥 cps聯(lián)盟美容護(hù)膚

摘要：培養(yǎng)基、細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的氨(NH3)和銨離子(NH4+)之間一直處于一種動(dòng)態(tài)平衡，它們之間的相互轉(zhuǎn)化受所處環(huán)境的pH影響，NH3和NH4+的動(dòng)態(tài)平衡是調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH處于穩(wěn)態(tài)的方式之一。

細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境對單抗的產(chǎn)量和質(zhì)量有著重大影響，如培養(yǎng)基成分、pH、DO、溫度等，另外對細(xì)胞具有毒性的代謝副產(chǎn)物乳酸和銨的累積同樣會影響細(xì)胞表現(xiàn)與抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量。培養(yǎng)基中乳酸的來源主要為葡萄糖的不完全降解，銨主要來自于谷氨酰胺的代謝降解和自發(fā)降解，當(dāng)然其他一些氨基酸或血清成分的代謝也是銨的來源之一。眾多學(xué)者就銨的機(jī)理及對細(xì)胞的生長、蛋白產(chǎn)量與質(zhì)量的影響均有研究，文中筆者就銨的毒性機(jī)理、對細(xì)胞及蛋白的影響、降低銨的措施等進(jìn)行簡要概述。

毒性機(jī)理

1.胞內(nèi)pH平衡

培養(yǎng)基、細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的氨(NH3)和銨離子(NH4+)之間一直處于一種動(dòng)態(tài)平衡，它們之間的相互轉(zhuǎn)化受所處環(huán)境的pH影響，NH3和NH4+的動(dòng)態(tài)平衡是調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH處于穩(wěn)態(tài)的方式之一。NH3是一種不帶電荷、脂溶性的小分子，可通過自由擴(kuò)散作用透過細(xì)胞膜，驅(qū)動(dòng)力為膜兩側(cè)的濃度差；而NH4+的膜穿透速度卻是比較慢的，因?yàn)槠渲荒茉谀芰康淖饔孟峦ㄟ^Na+K+-ATPase、Na+K+2Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等進(jìn)出細(xì)胞膜，而且采用這種方式時(shí)NH4+需要與K+等離子競爭轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)，可能會破壞細(xì)胞膜上的離子動(dòng)態(tài)平衡，影響胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

一般情況下，外界環(huán)境、細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)的NH3和NH4+處于動(dòng)態(tài)平衡，NH3在膜內(nèi)外的自由擴(kuò)散對細(xì)胞內(nèi)的pH進(jìn)行微調(diào)，但基本處于一種平衡狀態(tài)，如圖1a所示。當(dāng)向培養(yǎng)基中添加NH4Cl或者由于培養(yǎng)基中谷氨酰胺自發(fā)降解導(dǎo)致的NH4+增加時(shí)，如圖1b所示，在濃度梯度作用下NH3進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、線粒內(nèi)及其他含膜細(xì)胞器內(nèi)，從而使細(xì)胞內(nèi)的pH上升，對酶活造成不利影響，從而會限制細(xì)胞生長和代謝。

2.底物代謝循環(huán)

NH3和NH4+對細(xì)胞的影響還體現(xiàn)在代謝上，銨可以通過與酶的結(jié)合位點(diǎn)相互作用而影響酶活，例如對谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶的影響。谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺降解形成谷氨酸和銨，谷氨酰胺合成酶使反應(yīng)向相反的方向進(jìn)行，有研究報(bào)道稱提高銨濃度可以刺激谷氨酰胺酶的活性，其具體機(jī)制還不明確。另外，谷氨酸在谷氨酸脫氫酶作用下的進(jìn)一步降解時(shí)會產(chǎn)生氨和α-酮戊二酸，此過程需要NAD+的參與，如圖2所示，同時(shí)氨和α-酮戊二酸合成谷氨酸的反應(yīng)可以一定地解除銨對細(xì)胞的毒性效應(yīng)。

此外，糖代謝的關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶(PFK)的活性也受銨影響，高濃度的銨會擾亂糖代謝途徑，導(dǎo)致乳酸濃度升高。還有研究發(fā)現(xiàn)，銨會促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)UDP-N-乙酰半乳糖胺的合成，雖然作用機(jī)理還不明確，但高水平的UDP-N-乙酰半乳糖胺對細(xì)胞是具有毒性。由上可知，銨是底物代謝重要的參與者，同時(shí)也可影響部分酶的酶活，細(xì)胞培養(yǎng)過程中銨濃度失調(diào)對細(xì)胞生長的影響細(xì)胞是必然的。

對細(xì)胞及蛋白的影響

1.細(xì)胞生長及代謝

通過外源性的添加NH4Cl，學(xué)者們就銨濃度增加對細(xì)胞的影響進(jìn)行了研究，如圖3所示，Yang等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度隨NH4Cl的增加而降低，與對照相比添加40mM的NH4Cl時(shí)細(xì)胞密度降低了56%,而低濃度的NH4Cl(5mM之內(nèi))的對細(xì)胞的影響較小。

同時(shí)研究人員還對葡萄糖和幾種氨基酸的比合成或消耗速率進(jìn)行了測定，如下表所示，銨的添加增加了谷氨酸(glutamate)、丙氨酸(alanine)和甘氨酸(glycine)的合成速率，而加速了對葡萄糖和谷氨酰胺(glutamine)的消耗。銨濃度的提高不僅增加了細(xì)胞對能量的需求，還影響了細(xì)胞的代謝循環(huán)，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生長。當(dāng)然由于研究過程中采用的銨離子濃度往往超過細(xì)胞本身所產(chǎn)生的，并不能排除銨單一的對代謝影響的因素，還可能是胞內(nèi)pH增加的原因。

2.糖基化

細(xì)胞培養(yǎng)過程中高濃度的銨還會影響蛋白的糖基化水平，主要表現(xiàn)為降低糖鏈末端的唾液酸化水平、半乳糖苷化等。蛋白的糖基化過程發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)，有學(xué)者認(rèn)為銨濃度的增加會增加膜類細(xì)胞器內(nèi)的pH，進(jìn)而降低糖基轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰氨基葡糖轉(zhuǎn)移酶III/IV的活性；還有學(xué)者認(rèn)為，銨的添加是通過擾動(dòng)細(xì)胞的底物代謝平衡，而影響蛋白的糖基化水平。

Chen等就高濃度銨對CHO細(xì)胞糖基化的影響進(jìn)行了研究，其通過定量PCR(QRT-PCR)技術(shù)對糖基化相關(guān)基因(14個(gè)基因)的擴(kuò)增數(shù)進(jìn)行了分析。將銨壓力下CHO細(xì)胞和對照組的基因表達(dá)相比，發(fā)現(xiàn)有5種基因的表達(dá)對銨敏感，包括：UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、β(1,4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、α(2,3)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、GMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。如圖4所示，與對照相比添加銨的實(shí)驗(yàn)組α(2,3)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和GMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平較低，這不僅會導(dǎo)致胞液中唾液酸向高爾基體的轉(zhuǎn)動(dòng)量降低，還會影響糖鏈上的唾液酸連接，最終降低蛋白的唾液酸化。

數(shù)據(jù)也顯示，銨濃度增加時(shí)，β(1,4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)量也會降低，進(jìn)而引起β(1,4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶減少，影響半乳糖基化。雖然此時(shí)UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)會增加，但從沒報(bào)道過銨的添加會增加蛋白半乳糖化，其中的機(jī)制還需要更多的研究。而銨濃度對于UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的影響則會阻礙唾液酸的合成，及其向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而對唾液酸化產(chǎn)生不利影響。

降低銨的策略

細(xì)胞培養(yǎng)過程中銨的來源有兩個(gè)途徑，一是谷氨酰銨(Gln)的自發(fā)化學(xué)降解，二是谷氨酰銨等氨基酸的代謝。為消除由于Gln自發(fā)降解產(chǎn)生的銨，限制培養(yǎng)基中Gln的添加濃度可以降銨的積累，另外可以用更為穩(wěn)定的Gln派生物代替以減少其自發(fā)降解量，如甘氨酰谷氨酰胺。

大多數(shù)情況下，銨主要來源于谷氨酰胺酶作用下Gln轉(zhuǎn)化成谷氨酸(Glu)的過程，Gln自發(fā)降解產(chǎn)生的銨只占極少一部分。如果將Glu，而不是Gln添加到培養(yǎng)基中便可有效的減少銨的生成，但同時(shí)也會在一定程度下降低細(xì)胞的生長速率。與Glu的出發(fā)點(diǎn)類似，其他氨基酸的添加也可降低銨的積累。Chen等進(jìn)行了相關(guān)的研究，其通過外源性添加10mMNH4Cl到培養(yǎng)基模擬高濃度銨離子，并在此條件下測定了不同種氨基酸對細(xì)胞生長的影響。實(shí)驗(yàn)得出蘇氨酸(threonine)、脯氨酸(proline)和甘氨酸(glycine)可以抑制高濃度銨對細(xì)胞的毒性，與對照相比，分別使細(xì)胞終密度提高了15%、20%和25%，如圖5所示，其中絲氨酸(alanine)的添加作用負(fù)對照。對添加銨的實(shí)驗(yàn)組中對照組與蘇氨酸、脯氨酸和甘氨酸實(shí)驗(yàn)組的代謝參數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)氨基酸組的銨濃度要比對照組低，同時(shí)其谷氨酰胺濃度也要高些，而葡萄糖消耗和乳酸生成均要低些，這就說明三種氨基酸的添加促進(jìn)了細(xì)胞的碳代謝與氮循環(huán)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長。

優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)策略也可以降低銨的累積，例如對谷氨酰胺和葡萄糖的補(bǔ)料方式及補(bǔ)量進(jìn)行優(yōu)化，以其他糖類代替葡萄糖，如半乳糖、甘露糖、果糖等，主要是通過對細(xì)胞代謝路徑的調(diào)控來減少銨累積。采用物理移除培養(yǎng)系統(tǒng)中的銨也是一種選擇，例如透氣型、疏水多孔膜，離子交換膜或離子交換樹脂和電滲析等方法，然而這些方法只有應(yīng)用于產(chǎn)生大量銨離子的高密度細(xì)胞培養(yǎng)中才能體現(xiàn)對活細(xì)胞密度和抗體濃度的改善。

細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)代謝廢物銨的累積不僅會影響細(xì)胞的表現(xiàn)，還會對抗體的糖基化產(chǎn)生影響，追問其機(jī)理可能與細(xì)胞胞內(nèi)的pH平衡破壞與酶活下降有關(guān)。但是，對谷氨酰胺和葡萄糖的補(bǔ)料策略進(jìn)行優(yōu)化，或者采用其他氨基酸代替谷氨酰胺等均可控制銨的累積。

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