探討PAX1基因甲基化定量檢測在宮頸癌癌前病變?cè)\斷中的應(yīng)用價(jià)值。

　　方法選取2013年1月至2015年10月就診于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院的121例高危亞型人乳頭狀瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）感染患者為研究對(duì)象。根據(jù)病理學(xué)結(jié)果將其分為正常宮頸組（28例）、低級(jí)別病變組[宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepi-thelialneoplasia，CIN）Ⅰ，32例]、高級(jí)別病變組（CINⅡ～Ⅲ，34例）及癌變組[浸潤性宮頸癌（invasivecervicalcancers，ICC），27例]。收集各組患者的宮頸組織標(biāo)本及宮頸刮片，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和焦磷酸測序技術(shù)定量分析PAX1基因9個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平，并通過接受者操作特征曲線（ROC曲線）計(jì)算PAX1甲基化與各級(jí)別宮頸病變的關(guān)聯(lián)性。

　　結(jié)果癌變組、高級(jí)別病變組、低級(jí)別病變組、正常宮頸組PAX1基因9個(gè)位點(diǎn)的甲基化平均水平分別為4.66%、3.55%、2.10%、1.90%，組間比較差異均具有顯著性（P＜0.05）。各組患者宮頸刮片和宮頸組織PAX1甲基化水平比較差異均具有顯著性（P＜0.01），其中，癌變組PAX1甲基化發(fā)生率及水平均顯著高于其他三組（P＜0.05）。通過PAX1基因甲基化水平鑒別診斷宮頸癌和CIN，結(jié)果顯示其ROC曲線下面積為0.88（P＜0.001），具有較高的診斷能力。

　　關(guān)鍵詞：宮頸癌癌前病變；焦磷酸測序；PAX1；甲基化

　　研究資料表明，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率正逐年上升，已分別居女性惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第3位和第4位[1]。研究顯示，我國宮頸癌每年的新發(fā)病例數(shù)由2010年的2.85萬～13.75萬上升為2015年的4.58萬～18.85萬[2]。人乳頭狀瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）的持續(xù)性與反復(fù)性感染是宮頸癌最常見的病因之一[3]。研究表明，PAX1基因的異常甲基化表達(dá)升高，可在多個(gè)不同階段及層次上影響宮頸癌及癌前病變的病理進(jìn)程，與宮頸癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[4，5]。本研究基于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）技術(shù)及焦磷酸測序技術(shù)，定量分析正常宮頸、低級(jí)別病變宮頸、高級(jí)別病變宮頸以及患癌宮頸的細(xì)胞及組織刮片中PAX1基因的甲基化水平，定量檢測目的基因的甲基化水平，以明確其在區(qū)分各級(jí)宮頸病變中的臨床應(yīng)用價(jià)

　　值，現(xiàn)報(bào)道如下。

　　1、資料與方法

　　1.1、一般資料

　　選取2013年1月至2015年10月就診于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院的121例高危型HPV感染患者為研究對(duì)象。排除婦科良/惡性腫瘤病史、妊娠、免疫及造血系統(tǒng)疾病相關(guān)病史患者。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。121例患者依據(jù)病理分級(jí)不同分為正常宮頸組（28例）、低級(jí)別病變組[宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalintraepi-thelialneoplasia，CIN）Ⅰ，32例]、高級(jí)別病變組（CINⅡ～Ⅲ，34例）及癌變組[浸潤性宮頸癌（invasivecervicalcancers，ICC），27例]。正常宮頸組患者平均年齡為（35.26±7.14）歲，HPVDNA定量為（367.35±105.72）mg/ml；低級(jí)別病變組患者平均年齡為（38.45±7.45）歲，HPVDNA定量為（492.74±142.91）mg/ml；高級(jí)別病變組患者平均年齡為（38.78±7.26）歲，HPVDNA定量為（613.65±186.21）mg/ml；癌變組患者平均年齡為（37.28±2.15）歲，HPVDNA定量為（376.74±114.24）mg/ml。四組患者一般資料比較差異均無顯著性，具有可比性（P＞0.05）。

　　1.2、方法

　　1.2.1、宮頸標(biāo)本采集與保存

　　患者取截石位，常規(guī)消毒鋪巾，取少量宮頸病變部位的細(xì)胞制成宮頸刮片，陰道鏡下鉗取少量宮頸組織進(jìn)行病理活檢，并行HPV檢查，4℃保存待用。研究時(shí)行宮頸組織活檢，并收集宮頸刮片進(jìn)行PAX1基因的甲基化檢測。上述各組檢測結(jié)果最終以病理學(xué)檢查結(jié)果作為參照。

　　1.2.2、宮頸DNA提取、化學(xué)修飾與擴(kuò)增

　　參照德國Qiagen公司生產(chǎn)的試劑盒說明書分別提取DNA與亞硫酸氫鹽DNA后處理，然后進(jìn)行PAX1基因轉(zhuǎn)錄。PAX1基因外側(cè)上游引物：5'-AAGTTGATTTAGGGTTTGGGGT-3'；外側(cè)下游引物：5'-ACCCAGCTCATCCACACTCCC-3'。PAX1基因上游引物：5'-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3'，下游引物：5'-AAATACCCRAGACTAAACGC-3'。采用生物素

　　標(biāo)記下游引物5'末端。

　　1.2.3、焦磷酸DNA測序

　　參照焦磷酸測序儀（PyroMarkQ96ID焦磷酸測序儀，美國）中甲基化分析相關(guān)要求，首先制備單鏈DNA模板，然后進(jìn)行焦磷酸測序。目的基因所用引物：5'-GGAGGTAGGTTTTGGAG-3'，可測得PAX1基因有9個(gè)胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤島（cytosine-phosphoricacidguanine，CpGisland）。獲得PAX1基因測序結(jié)果后，以單個(gè)基因所有檢測位點(diǎn)的甲基化率的平均值表示每組樣本的基因甲基化水平。經(jīng)焦磷酸測序技術(shù)，對(duì)相關(guān)目的基因的9個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行甲基化定量測試分析。以試劑盒提供的通用DNA作為內(nèi)參。不同位點(diǎn)檢測標(biāo)本中，某單一位點(diǎn)的甲基化水平與內(nèi)參中該位點(diǎn)的甲基化水平的比值，用以表示該位點(diǎn)的甲基化發(fā)生率。

　　1.3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

　　所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均由SPSS17.0軟件處理。計(jì)量資料以x±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制不同組別的接受者操作特征曲線（ROC曲線），通常以ROC曲線下面積進(jìn)行比較。相關(guān)性研究使用散點(diǎn)圖形式。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05表示差異有顯著性。

　　2、結(jié)果

　　2.1、宮頸組織PAX1基因甲基化的定量分析

　　正常宮頸組、低級(jí)別病變組、高級(jí)別病變組、癌變組患者病變組織中PAX1基因相關(guān)位點(diǎn)甲基化水平分別為1.90%、2.10%、3.55%、4.66%，各組組間比較差異均具有顯著性（P＜0.05）。

　　2.2、四組患者病變組織中PAX1基因甲基化水平的定量分析

　　四組患者病變組織中PAX1基因甲基化發(fā)生率和HPV陽性率比較差異均具有顯著性（P＜0.05）（表1）。各組患者宮頸刮片和宮頸組織PAX1基因甲基化水平組間兩兩比較差異均具有顯著性（P＜0.05）（表2），且癌變組患者宮頸刮片和宮頸組織PAX1基因甲基化水平顯著高于其他三組（P＜0.05）。宮頸刮片與癌變組織PAX1基因甲基化之間的相關(guān)性分析見圖1，r≥0.80表示宮頸刮片與癌變組織PAX1甲基化水平具有相關(guān)性（P＜0.05）。

　　2.3、PAX1基因甲基化水平診斷宮頸癌和CIN的相關(guān)性分析

　　3、討論

　　臨床上，從宮頸癌前病變發(fā)展至宮頸癌大多需要數(shù)年甚至幾十年的時(shí)間。宮頸癌早期癥狀多不明顯，待癥狀明顯、惡性程度加劇時(shí)往往已屬疾病的中晚期。因此，研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有助于臨床診斷和治療的有效分子標(biāo)志物對(duì)提高宮頸癌患者的生存率具有重要意義[6]。既往研究結(jié)果顯示，宮頸癌變過程包括諸多基因及表觀與調(diào)控基因的改變[4]，其中最重要的是以DNA甲基化為代表的表觀遺傳學(xué)改變，該過程主要表現(xiàn)為腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生異常，導(dǎo)致目的基因及調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄失活，進(jìn)而促使腫瘤的發(fā)生及發(fā)展；65%～95%的宮頸癌組織及細(xì)胞中可檢測到DNA甲基化。因此，在宮頸脫落細(xì)胞及宮頸組織活檢中，將基因甲基化作為一項(xiàng)檢測指標(biāo)有助于實(shí)現(xiàn)宮頸癌的早期診斷。

　　隨著診斷技術(shù)的發(fā)展以及細(xì)胞學(xué)檢查等技術(shù)的推廣及普及，HPV病毒微量提取[7,8]與雜交法[9]的廣泛應(yīng)用，已使多種類型的宮頸癌前病變及早期浸潤性宮頸癌得到診治。統(tǒng)計(jì)分析表明，感染HPV者并不一定會(huì)發(fā)生癌前病變或?qū)m頸癌，這提示在宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展過程中，可能存在其他協(xié)同因子的共同促進(jìn)效應(yīng)?；诨蚝偷鞍姿降奶禺愋詸z測方法應(yīng)運(yùn)而生。多項(xiàng)研究證實(shí)，癌基因的異常表達(dá)在多方面影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展（如細(xì)胞增殖與分裂的調(diào)控）；抑癌基因的異常甲基化（調(diào)控失調(diào)）亦可抑制抑癌基因的表達(dá)與下游基因的調(diào)控[10]。已有研究顯示PAX1基因甲基化水平在宮頸癌組織中異常增高，并與啟動(dòng)子的甲基化相關(guān)，且PAX1基因甲基化可在宮頸癌患者的脫落細(xì)胞中被檢測到[11-13]。還有研究顯示，PAX1基因甲基化陽性率與宮頸癌的病理分級(jí)和淋巴轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切，因此PAX1基因有望成為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志物[14-19]。目前多數(shù)研究僅關(guān)注PAX1基因甲基化狀態(tài)的定性檢測，還難以進(jìn)行精確地量化判斷與評(píng)價(jià)。

　　既往研究發(fā)現(xiàn)，PAX1基因甲基化水平對(duì)宮頸癌的診斷有一定的幫助。Kim等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PAX1基因甲基化檢測可明顯提高宮頸脫落細(xì)胞及活檢組織檢測的準(zhǔn)確性，并且可替代50%的陰道鏡檢查和宮頸組織活檢。Nikolaidis等[20]指出PAX1基因甲基化水平可作為宮頸癌早期診斷的一種輔助手段，其區(qū)分CIN2與正常組織的靈敏度與特異度分別為0.66和0.92；此外，PAX1基因甲基化的水平區(qū)分CIN3與正常組織的靈敏度與特異度分別為0.77和0.92，與其相對(duì)應(yīng)的ROC曲線下面積分別為0.923和0.931，具有較高的診斷價(jià)值。

　　但既往研究未對(duì)患病類型進(jìn)行區(qū)別診斷。本研究使用更為敏感而特異性強(qiáng)的定量分析方法，結(jié)果顯示，癌變組PAX1基因甲基化發(fā)生率顯著高于其他三組；宮頸刮片和宮頸組織中PAX1基因甲基化水平在各組之間差異均具有顯著性，且癌變組患者PAX1基因甲基化水平顯著高于其他三組。上述結(jié)果提示：通過PAX1基因甲基化發(fā)生率及其定量水平的測定，可以在一定程度上對(duì)宮頸癌高危人群進(jìn)行篩選，并為后期定期隨訪觀察提供依據(jù)。此外，本研究通過對(duì)PAX1基因甲基化水平鑒別診斷不同癌前病變?nèi)巳号c宮頸癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其ROC曲線下面積為0.88，具有較高的診斷鑒別能力。當(dāng)其在最佳閾值下，分析PAX1基因甲基化水平檢測癌前病變與宮頸癌的靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的宮頸脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測。本研究結(jié)果能夠解決臨床上基于PAX1基因甲基化的部分患者的診療問題，為臨床治療提供參考依據(jù)。

　　綜上所述，定量檢測宮頸組織細(xì)胞中的PAX1基因甲基化水平，用以診斷宮頸癌前病變具有臨床應(yīng)用價(jià)值。