乙型肝炎病毒（HBV），簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科（Hepadnavividae），可導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)生，給全球帶來嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，全球有20多億人曾受到過乙型肝炎病毒（HBV）感染，大約3.5億至4億人罹患慢性乙肝病毒（HBV）感染，在亞洲和非洲發(fā)病率尤其高。我國的乙肝病毒感染率約60%-70%；乙肝表面抗原攜帶率約占總?cè)丝诘?.18%，以此計算，全國約有9300萬人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。

　　盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物可以控制乙型肝炎病毒，但卻不能完全清除它。因此，一旦停止治療患者肝臟中的HBV會重新活化。這是因為cccDNA“匿藏”在細(xì)胞核中。

　　細(xì)胞外的乙型肝炎病毒DNA是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA（relaxedcircularDNA，rcDNA）分子。HBV的基因組（rcDNA）進(jìn)入到細(xì)胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主細(xì)胞因子的幫助下修復(fù)成共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復(fù)制的原始模板。

　　只要還存在于肝細(xì)胞中，乙肝病毒cccDNA的復(fù)制就不會停止，并與病毒蛋白裝配成新的完整HBV病毒顆粒，以芽生的方式再感染健康的肝細(xì)胞，而這是導(dǎo)致乙肝復(fù)發(fā)的根本原因。因此，盡管每個肝細(xì)胞內(nèi)只有約5～50個cccDNA拷貝，但是只要這些cccDNA池穩(wěn)定，就可以使得病毒的持續(xù)感染延續(xù)，因而清除肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA是乙肝徹底治愈所必需的。

　　CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向結(jié)合特異性的DNA序列，誘導(dǎo)靶DNA雙鏈發(fā)生精確切割。在哺乳動物細(xì)胞中，這樣的切割能夠被一種被稱作非同源末端連接（non-homologousend-joining,NHEJ）的緊急修復(fù)系統(tǒng)快速地修復(fù)。NHEJ是高效的，但是并不很準(zhǔn)確，因而經(jīng)常導(dǎo)致一些DNA堿基在修復(fù)位點(diǎn)上插入或剔除。鑒于每次讀取DNA時是按密碼子（每個密碼子由連續(xù)的三個堿基組成）讀取的，在關(guān)鍵位點(diǎn)上發(fā)生的這些小的DNA序列變化經(jīng)常破壞相應(yīng)的基因和它的蛋白產(chǎn)物的功能?；?，世界各地的研究人員嘗試?yán)肅RISPR/Cas9系統(tǒng)治療HBV感染，并且取得重大進(jìn)展。

　　1.SciRep：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效地抑制HBV

　　在一項新研究中，麻省理工學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對受到HBV感染的哺乳動物肝細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，從中刪除了乙肝病毒（HBV）DNA。他們靶向切割了HBV病毒共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）中的一些特異性位點(diǎn)。

　　在這項研究中，VyasRamanan和同事們設(shè)計了24條單向?qū)NA（sgRNA）來靶向從在線病毒序列信息資源庫中鑒別出的一些HBV基因組位點(diǎn)。經(jīng)過初篩測試后，研究小組將三種最有效的sgRNA和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然后將它們轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)將HBVDNA整合到宿主基因組的人類肝細(xì)胞內(nèi)。

　　通過利用包含整合性HBV基因組DNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系展開實驗，研究人員觀察到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時cccDNA下降了92%。他們還觀察到HBV病毒基因表達(dá)和復(fù)制水平顯著減少。

　　如今，Ramanan計劃在人類肝臟嵌合小鼠模型中測試這一方法，以評估和優(yōu)化傳遞方法和給藥方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到達(dá)人類功能性的治愈。

　　2.MolTherNucleicAcids：利用CRISPR/Cas9抑制HBV感染

　　在一項新的研究中，為了研究源自傳染性HBV的cccDNA是否能夠被直接靶向摧毀，來自美國?？怂共趟拱┌Y中心（FoxChaseCancerCente）的研究人員在表達(dá)HBV受體---鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodiumtaurocholatecotransportingpolypeptide,NTCP）---的人HepG2中使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)。他們測試了不同的HIV特異性的向?qū)NA（gRNA），并證實它們能夠高達(dá)8倍地抑制HBV感染。這種抑制是HBVcccDNA發(fā)生突變和缺失---類似于Cas9切割染色體DNA和隨后基于NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)時觀察到的情形---所導(dǎo)致的。α干擾素（IFN-α）并不對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的抗病毒活性產(chǎn)生可衡量的影響，這提示著Cas9和NHEJ活性并不受這種細(xì)胞因子（即IFN-α）誘導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)的影響。

　　3.MolTher：利用CRISPR/Cas9讓HBVcccDNA功能性滅活

　　在一項新的研究中，通過采用下一代測序（NGS）技術(shù)，來自美國?？怂共趟拱┌Y中心（FoxChaseCancerCente）的ChristophSeeger、JiASohn和同事們確定了在Cas9切割和基于非同源末端連接（NHEJ）的修復(fù)后，HBVcccDNA所發(fā)生的完整突變譜。他們發(fā)現(xiàn)，90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割。此外，研究結(jié)果還表明，在Cas9切割后對HBVDNA進(jìn)行基因編輯的效率是在對被HBV感染的細(xì)胞進(jìn)行α干擾素（IFN-α）處理后發(fā)生的APOBEC蛋白介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基作用的1500倍以上。研究還發(fā)現(xiàn)，以前用來檢測DNA胞嘧啶脫氨基作用的3D-PCR方法方法高估了發(fā)生基因編輯的HBVDNA的數(shù)量和頻率。

　　總之，研究人員證實CRISPR/Cas9系統(tǒng)是迄今為止在功能上讓HBVcccDNA失活和提供一種慢性乙肝治愈療法的最好途徑。

　　4.GeneTher：我國科學(xué)家利用CRISPR破壞乙肝病毒

　　2015年2月5日，來自我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)院研究所、第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、日本京都大學(xué)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院等處的研究人員，在Nature旗下GeneTherapy期刊上發(fā)表一項最新的研究成果，題為“Harnessingtheclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat（CRISPR）/CRISPR-associatedCas9systemtodisruptthehepatitisBvirus”。在這項研究中，研究人員研究靶向乙肝表面抗原（HBsAg）編碼區(qū)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中和活的小鼠體內(nèi)的效果。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9可在體內(nèi)和體外抑制HBV復(fù)制和表達(dá)，可能是治療HBV感染的一種新策略。

　　5.MolTherNucleicAcids：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體內(nèi)促進(jìn)肝內(nèi)HBV模板清除

　　在當(dāng)前的抗病毒治療下，HBVcccDNA持續(xù)存在是根治慢性乙肝的一大障礙。治愈慢性乙肝需要新的策略來特異性地破壞HBVcccDNA。為了研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)是否能夠切割HBV基因組，來自中國國立臺灣大學(xué)的研究人員設(shè)計出8種針對A基因型HBV的gRNA。利用這些HBV特異性的gRNA，CRISPR/Cas9系統(tǒng)顯著性地降低感染上HBV表達(dá)載體的Huh7細(xì)胞中的乙肝核心抗原（HBcAg）和乙肝表面抗原（HBsAg）產(chǎn)生。在這8種篩選出的gRNA中，他們鑒定出兩種有效的gRNA。有趣的是，其中的一種靶向保守性HBV序列的gRNA在不同基因型的HBV中都能發(fā)揮作用。

　　利用一種流體動力學(xué)-HBV持續(xù)存在小鼠模型，研究人員進(jìn)一步證實這種CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠切割肝內(nèi)含有HBV基因組的質(zhì)粒，促進(jìn)它在體內(nèi)被清除，從而導(dǎo)致血液中的HBsAg水平下降。

　　這些數(shù)據(jù)提示著CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在體外和體內(nèi)破壞HBV表達(dá)模板，并且表明它有潛力根除持續(xù)性HBV感染。

　　6.VirusRes：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)抗HBV效應(yīng)

　　在一項新的研究中，來自中國同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向剔除HBV基因組中的保守性區(qū)域。通過讓核酸內(nèi)切酶Cas9攜帶HBVS基因和X基因的同源序列，他們構(gòu)建出pCas9。通過利用pCas9開展實驗，他們證實pCas9-2能夠更好抵抗HBV產(chǎn)生，而且在Huh7和HepG2細(xì)胞之間沒有顯著差異。

　　在M-TgHBV的HBV感染小鼠模型中，注射pCas9會降低血液中的HBsAg水平和肝臟中的HBcAg水平。

　　總之，這種人工構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)抗HBV效應(yīng)，而且有潛力作為一種新的療法治療慢性HBV感染。

　　7.SciRep：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)破壞HBVS基因和X基因保守性序列

　　為了在治療上應(yīng)用于人體，人工設(shè)計出的核酸內(nèi)切酶Cas9應(yīng)當(dāng)能夠識別不同基因型的HBV，同時產(chǎn)生最小的脫靶效應(yīng)。

　　針對此，在一項新的研究中，德國研究人員鑒定出HBV基因組的S區(qū)域和X區(qū)域在不同基因型中都保守的HBV序列，而且能夠利用一種Cas9酶特異性地和高效地靶向切割這些保守性序列。這一方法不僅破壞報告細(xì)胞系中的游離HBVcccDNA和HBV在染色體上的整合靶位點(diǎn)，而且也破壞慢性感染和新感染的肝癌細(xì)胞系中的HBV復(fù)制。

　　這些數(shù)據(jù)提示著將CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為旨在治愈HBV感染的新策略具有可行性。

　　8.WorldJGastroenterol：利用雙gRNA指導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效地抑制HBV復(fù)制

　　為了篩選和研究有效地抵抗A、B、C和D基因型HBV的gRNA，來自中國北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部的研究人員總共設(shè)計出15種gRNA（分別記為gRNA-1，gRNA-2，…，gRNA-15）。他們從中選擇了11種靶向HBV基因組調(diào)節(jié)區(qū)域的雙gRNA組合。他們研究了每種gRNA和這11種雙RNA組合抑制A、B、C和D基因型HBV復(fù)制的效率。

　　研究人員證實所有的gRNA能夠顯著地抑制體外細(xì)胞培養(yǎng)物中的HBsAg或HBeAg產(chǎn)生，所有雙RNA組合能夠高效地抑制A、B、C和D基因型HBV中的HBsAg或HBeAg產(chǎn)生，而且當(dāng)與單個gRNA相比時，雙RNA組合抑制HBsAg或HBeAg產(chǎn)生的效率顯著增加。

　　再者，通過利用PCR直接測序，研究人員證實這些雙gRNA組合能夠通過移除這兩種使用的gRNA的切割位點(diǎn)之間的序列片段，特異性地破壞HBV表達(dá)模板。最為重要的是，gRNA-5和gRNA-12的雙gRNA組合不僅能夠高效地抑制HBsAg和/或HBeAg產(chǎn)生，而且也破壞HepAD38細(xì)胞中的HBVcccDNA池。

　　這些結(jié)果提示著CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠高效地破壞HBV表達(dá)模板（A、B、C和D基因型HBV），而且沒有明顯的細(xì)胞毒性。

　　9.JGenVirol：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制不同基因型HBV復(fù)制

　　為了研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)是否可能破壞HBVDNA模板，來自中國武漢大學(xué)的研究人員設(shè)計出8種靶向不同基因型HBV的保守區(qū)域的gRNA，而且這些gRNA能夠在體外和體內(nèi)顯著地抑制HBV復(fù)制。再者，這種HBV特異性的gRNA/Cas9系統(tǒng)能夠抑制不同基因型HBV在細(xì)胞中的復(fù)制，而且利用單個gRNA/Cas9系統(tǒng)能夠顯著降低HBVDNA，而且利用不同的gRNA/Cas9系統(tǒng)組合能夠清除HBVDNA。

　　10.AntiviralRes：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效抑制HBV復(fù)制

　　作為一種新的基因組編輯工具，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠被用來準(zhǔn)確地和高效地改造和修飾基因組DNA。

　　在一項新的研究中，來自中國蘇州大學(xué)的研究人員合成出4種靶向HBV基因組保守區(qū)域的單向?qū)NA（sgRNA）。在Huh7細(xì)胞和HBV復(fù)制性細(xì)胞HepG2.2.15中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)降低HBV產(chǎn)生。他們進(jìn)一步證實CRISPR/Cas9的直接切割和這種切割介導(dǎo)的突變發(fā)生于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的HBVcccDNA中。

　　在攜帶HBVcccDNA的小鼠模型中，通過快速地尾靜脈注射含sgRNA-Cas9的質(zhì)粒導(dǎo)致較低水平的HBVcccDNA和HBV蛋白產(chǎn)生。

　　總之，這種CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確地和高效地靶向HBVcccDNA和抑制HBV復(fù)制。它有可能被用來治療慢性HBV感染。

　　11.Virology：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制HBVDNA積累

　　在一項新的研究中，來自美國杜克大學(xué)和埃默里大學(xué)的研究人員通過對細(xì)菌Cas9基因和單向?qū)NA（sgRNA）進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，觀察到在體外的HBV慢性感染和新感染的模型中，HBVDNA產(chǎn)生受到高效抑制。HBV特異性的Cas9/sgRNA組合降低總HBVDNA水平高達(dá)1000倍左右和降低HBVcccDNA水平高達(dá)10倍左右，而且也通過突變讓殘留的絕大多數(shù)HBVDNA失活。

　　總之，這些數(shù)據(jù)提供概念驗證表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)有潛力有效地剔除慢性HBV感染者體內(nèi)的HBVcccDNA池。