基因編輯，尤其是CRISPR/Cas9系統(tǒng)，從某種意義上來說就像是一輛正在生產(chǎn)的閃亮新車，在構(gòu)建主要框架的同時也開始啟動，而且還準備開始一路飚車。

　　自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因編輯之后，這個前途光明的技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用到了許多研究領(lǐng)域，而且隨著技術(shù)的改良，越來越多的研究團隊利用CRISPR進行大規(guī)模的遺傳篩選，比如用于識別導(dǎo)致癌癥抵抗治療的突變，或者加速藥物靶標評估。RNA干擾，相比于CRISPR/Cas9在遺傳篩選方面的作用，無論是效率和特異性方面，目前都難以望其項背了。

　　同時，譬如MD安德森癌癥中心等處的研究人員也開始進一步了解CRISPR/Cas9的特性和局限性，了解它到底能做些什么，比如分析人類細胞系。CRISPR/Cas9工具箱不斷的擴大，Broad研究院的張鋒等人也開始利用Cas9結(jié)合到基因組上，停止或者加強轉(zhuǎn)錄。他們對于CRISPR/Cas9在遺傳篩選方面的作用，有何看法呢？

　　張鋒研究組曾在“RationallyengineeredCas9nucleaseswithimprovedspecificity”這篇文章中，探討了從化膿性鏈球菌中改變了組成Cas9酶的1400個氨基酸中的3個氨基酸，從而將基因編輯中脫靶效應(yīng)降低到了幾乎無法檢測的水平的可能性。當RNA與DNA不是那么配對的時候，Cas9內(nèi)切酶會誘導(dǎo)脫靶突變，導(dǎo)致這無法成為臨床試驗中的精確基因編輯。

　　為了能容納下Cas9蛋白，DNA鏈需要分開，張鋒研究組進行了結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)在Cas9蛋白位點的負電荷非靶標DNA上有一個合適的正電荷凹槽。“我們認為如果能中和部分正電荷，就能消弱穩(wěn)定性，從而能Cas9更具特異性，”張鋒說。

　　他們利用已知定位在特殊脫靶位點上的導(dǎo)向RNAs來進行了這個方法的實驗，研究組構(gòu)建出了Cas9的32個單突變，然后將每個突變通過EMX1基因有效，但容易出現(xiàn)錯誤的導(dǎo)向RNA，靶向EMX1。

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中五個能完成EMX1基因的基因編輯，但是會十倍比率的減少脫靶位點的切割，之后研究人員又嘗試利用Cas9突變?nèi)デ袛嗔硗庖粋€基因：VEGFA，這種基因已知能在兩個之前識別的脫靶位點上進行切割。雖然所有的Cas9突變都減少了脫靶效應(yīng)，但是研究人員認為他們應(yīng)該結(jié)合這些突變，讓Cas9更加特異性。因此他們利用三點突變體（triple-pointmutations）產(chǎn)生了兩個不同的突變，發(fā)現(xiàn)“我們能完成靶向激活，并進一步減少脫靶活性，”張鋒說。

　　如何利用CRISPR發(fā)現(xiàn)未知基因功能

　　CRISPR系統(tǒng)的一大亮點在于導(dǎo)向RNAs的特異性，張鋒說，這樣一來我們就能生成靶向每個基因或某個基因多個位點的CRISPR導(dǎo)向慢病毒庫。然后再轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞系，獲得單個基因或被激活，或被失活的細胞池。

　　2014年，2015年張鋒研究組陸續(xù)發(fā)表了相關(guān)的不少文章，如其研究組曾構(gòu)建了靶向18,080個基因（64,751個獨特靶向序列）的全基因組范圍CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文庫慢病毒庫，用于進行在人類細胞中的正向和負向選擇性篩選。之后這個研究組還建立了70,290個導(dǎo)向RNA的文庫，來靶標人類基因組超過兩萬個基因，由此鑒定出了讓黑色素瘤抵抗藥物PLX-4720的基因。PLX-4720對于攜帶BRAF突變的患者療效比較好，殘存下來的癌細胞會長成新的腫瘤，導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)。

　　BRAFV600E是一個著名的致癌突變，美國FDA曾批準的抗癌藥Zelboraf（vemurafenib，羅氏）就是靶向這個突變，但是隨著細胞快速突變，一些患者在第24周治療時出現(xiàn)了抗性，腫瘤復(fù)發(fā)。

　　“這也許是一個機會，我們可以利用全基因組文庫檢測哪些基因在打開或者關(guān)閉的時候，導(dǎo)致腫瘤細胞對vemurafenib產(chǎn)生了抗性，”張鋒說。

　　這種CRISPR基因敲除文庫采用了能靶向基因組中所有保守編碼外顯子的導(dǎo)向指引，“在設(shè)計這些多條件篩選實驗的時候，我們用的都是多個導(dǎo)向，因此出現(xiàn)了一些冗余，同時也能告訴了我們，任何單個導(dǎo)向的效率并不是由于脫靶修飾，”他補充道。研究組也嘗試驗證了他們的這些新候選，將研究結(jié)果與之前的RNAi篩選進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能找到幾個vemurafenib抗性的tophits，而RNAi篩選只能找到一個。

　　張鋒研究組研發(fā)的功能獲得突變CRISPR篩選系統(tǒng)也能幫助完成了vemurafenib抗性研究，他將這個新型CRISPR激活基因篩選工具稱為SAM，也就是協(xié)同激活調(diào)控子（synergisticactivationmediator，生物通譯），利用這一系統(tǒng)，其研究組激活了12個不同的基因，這些基因如果采用之前的方法很難進行開啟，“而且之前系統(tǒng)中許多基因?qū)嶋H上都無法真正激活，這一新系統(tǒng)能百倍，或者千倍的激活轉(zhuǎn)錄，”張鋒說。

　　張鋒實驗室目前嘗試通過識別基因編輯更多有用的酶，進一步擴增CRISPR編輯工具箱。比如去年秋天他們發(fā)現(xiàn)了Cpf1，這是具有不同剪切活性的DNA內(nèi)切酶，能用于某些情況。新Cpf1系統(tǒng)也具有一些不同于Cas9的地方：

　　1.在它的自然形態(tài)下，DNA切割酶Cas9與兩條小RNAs形成了一種復(fù)合物，兩條RNAs均是獲得切割活性的必要條件。Cpf1系統(tǒng)更簡單一些，它只需要一條RNA。Cpf1酶也比標準SpCas9要小，使得它更易于傳送至細胞和組織內(nèi)。

　　2.且有可能最重要的是，Cpf1以一種不同于Cas9的方式切割DNA。當Cas9復(fù)合物切割DNA時，它切割的是同一位點的兩條鏈，留下的“平端”（bluntends）在重新連接時往往會發(fā)生突變。采用Cpf1復(fù)合物生成的兩條鏈切口是偏移的，在裸露端留下了短懸端（overhang）。這預(yù)計有助于精確插入，使得研究人員能夠更有效及精確地整合一段DNA。

　　3.Cpf1切口遠離識別位點，這意味著即便在切割位點靶基因突變，仍然可以進行再度切割，提供了多次機會來校正編輯。

　　4.Cpf1系統(tǒng)為選擇靶位點提供了新的靈活性。像Cas9一樣，Cpf1復(fù)合物必須首選附著PAM,短序列，選擇的靶點靠近自然存在的PAM序列。Cpf1系統(tǒng)識別的PAM序列與Cas9截然不同。這在靶向某些基因組如瘧原蟲及人類基因組時可能是個優(yōu)勢。

　　此外，研究組還發(fā)現(xiàn)了其它CRISPR/Cas系統(tǒng)C2c1,C2c2andC2c3，目前他們正在研究其作用機制。