【體外研究】：碳酸氫鈉對(duì)口腔生物膜的物理性破壞

　　JonathanPratten，JoannaWiecek，NicolaMordan，NishaPatel，DavidSpratt，AndrewMiddleton

　　研究目的

　　用已建立的恒定厚度生物膜發(fā)酵裝置（CDFF）代表菌斑體外模型系統(tǒng)，量化與可視化碳酸氫鈉對(duì)口腔生物膜的破壞，從而闡明碳酸氫鈉的作用機(jī)制。

　　研究處理方案

　　將生物膜置于不同濃度的微細(xì)碳酸氫鈉中測(cè)試2分鐘（代表標(biāo)準(zhǔn)的刷牙時(shí)間）：

　　8%碳酸氫鈉溶液

　　17%碳酸氫鈉溶液

　　33%碳酸氫鈉溶液

　　67%碳酸氫鈉溶液

　　對(duì)照：磷酸緩沖液（PBS）(0%碳酸氫鈉)

　　研究方法與材料

　　培養(yǎng)液：收集15例受試者的等量唾液樣本混合，加入丙三醇制成混合儲(chǔ)備培養(yǎng)液（終濃度為10%，v/v）。

　　體外模型參數(shù)：

　　-將恒定厚度生物膜發(fā)酵裝置（CDFF）置于培養(yǎng)箱中，恒溫在36°C（代表口腔）。

　　-用直徑為5mm的羥基磷灰石圓板模擬牙齒表面，作為底層嵌入300μm深度以模擬厚厚的菌斑。

　　-取1ml混合的唾液培養(yǎng)液加入500ml的人工唾液中，隨后將此混合液連續(xù)泵入CDFF中。保持有氧環(huán)境，將人工唾液作為生長(zhǎng)介質(zhì)，泵入速率為0.72L/天（代表人每天的唾液流速）。

　　生物膜處理：在滅菌條件下，將含有生物膜的羥基磷灰石圓盤從CDFF中取出，用4種碳酸氫鈉溶液（8%、17%、33%或67%）中的一種或?qū)φ杖芤禾幚?分鐘，輕輕晃動(dòng)。

　　培養(yǎng)分析：將培養(yǎng)物放入1ml含5顆玻璃珠的滅菌磷酸緩沖液中，迅速搖勻制成懸液。進(jìn)一步將懸液進(jìn)行連續(xù)稀釋，點(diǎn)到苛養(yǎng)厭氧培養(yǎng)基中，計(jì)算總厭氧菌計(jì)數(shù)。

　　生物膜可視化：取分別含2μLBacLight？活/死細(xì)胞染色劑A和2μLBacLight？活/死細(xì)胞染色劑B的無(wú)菌蒸餾水加到羥基磷灰石圓盤上。黑暗中培養(yǎng)10分鐘后，使用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）檢測(cè)生物膜。

　　電鏡分析：用具有導(dǎo)電粘性并涂有碳涂層的鋁針針尖蘸取生物膜進(jìn)行25kV掃描電鏡分析（SEM）。

　　研究結(jié)果

　　與對(duì)照組（0%碳酸氫鈉）相比，各濃度的碳酸氫鈉溶液對(duì)新形成不久的生物膜（2天）中的厭氧菌（生長(zhǎng)不需要氧氣的細(xì)菌）數(shù)均無(wú)任何影響。由于在新形成不久的生物膜中可能尚未形成表面多糖基質(zhì)，因此這一結(jié)果支持了碳酸氫鈉是通過(guò)破壞幫助細(xì)菌黏附到牙齒表面的表面多糖基質(zhì)而發(fā)揮作用的假說(shuō)。

　　與對(duì)照組相比，各濃度的碳酸氫鈉溶液均可顯著減少中位膜齡（7天）生物膜中的厭氧菌數(shù)，首次在體外試驗(yàn)中證實(shí)了碳酸氫鈉對(duì)菌斑生物膜的物理性清除作用。

　　–67%碳酸氫鈉的清除比例最高，清除的厭氧菌數(shù)至少是對(duì)照組的100倍。

　　–與新形成不久的生物膜相比，在較成熟的生物膜中有足夠的時(shí)間形成表面多糖基質(zhì)，碳酸氫鈉對(duì)較成熟生物膜中菌斑的物理性破壞可能是因?yàn)樘妓釟溻c破壞了表面多糖基質(zhì)。

　　這是葛蘭素史克可視化碳酸氫鈉有效清除菌斑生物膜的首個(gè)體外研究

　　與對(duì)照組相比，各濃度的碳酸氫鈉溶液均可減少成熟（14天）生物膜中的厭氧菌數(shù)，且作用相當(dāng)。

　　試驗(yàn)中各濃度的碳酸氫鈉均可有效清除中位膜齡和成熟生物膜中的菌斑

　　成熟生物膜的CLSM與SEM圖顯示，與對(duì)照生物膜相比，67%碳酸氫鈉可清除大量的生物膜生長(zhǎng)及其結(jié)構(gòu)。在使用碳酸氫鈉處理前，SEM圖顯示在成熟生物膜中有大量的多層結(jié)構(gòu)，而在使用67%碳酸氫鈉處理后多層結(jié)構(gòu)變成了單層細(xì)胞。

　　結(jié)論

　　這是葛蘭素史克可視化碳酸氫鈉有效清除菌斑生物膜的首個(gè)體外研究。

　　有假說(shuō)認(rèn)為碳酸氫鈉通過(guò)破壞表面多糖基質(zhì)（細(xì)菌通過(guò)其粘附到牙齒表面）而有效清除菌斑，從而促進(jìn)刷牙時(shí)對(duì)菌斑的物理性清除過(guò)程。

　　研究結(jié)果支持了碳酸氫鈉破壞表面多糖基質(zhì)的能力。