嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞免疫療法來(lái)源于過(guò)繼性T細(xì)胞療法(ACT)，現(xiàn)在有三種形式的ACT用于癌癥治療，包括：腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)；T細(xì)胞受體(TCR)T細(xì)胞；CART細(xì)胞。
得益于細(xì)胞工程技術(shù)的快速進(jìn)展，使得嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞免疫療法在腫瘤臨床中除頑固腫瘤外均取得了
持久的臨床療效，表現(xiàn)出了巨大的潛力。更令人鼓舞的是，自體T細(xì)胞工程表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)，CD19B淋巴細(xì)胞分子近期被FDA批準(zhǔn)用于治療頑固性前-B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和擴(kuò)散大B細(xì)胞淋巴瘤。
2018年3月23日在Science雜志上發(fā)表的最新關(guān)于(CAR)T細(xì)胞免疫療法的綜述文章《CARTcellimmunotherapyforhumancancer》。向我們著重介紹了CART細(xì)胞療法的前景、在實(shí)體瘤治療中的應(yīng)用和在使用和商業(yè)化中出現(xiàn)的新差距等內(nèi)容。本文將針對(duì)性探討當(dāng)前CAR-T細(xì)胞療法在腫瘤研究中的進(jìn)展、機(jī)遇和挑戰(zhàn)。
1.TCRs療法)
TCRs包括一個(gè)α和β輕鏈與T細(xì)胞表面CD3復(fù)合物非共價(jià)結(jié)合。當(dāng)TCR識(shí)別肽非共價(jià)結(jié)合抗原提呈細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面的MHC時(shí)發(fā)生T細(xì)胞活化。先前開發(fā)的用于對(duì)抗轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的TCRT細(xì)胞免疫療法，例如結(jié)合人淋巴細(xì)胞抗原A2(HLA-A2)-來(lái)源于黑色素細(xì)胞分化抗原的限制肽的TCRs，以及具有更高親和力的TCR靶點(diǎn)MART-1的TCRs，盡管證明了療效有改善，但是也帶來(lái)了對(duì)皮膚、眼和耳蝸正常黑色素細(xì)胞的靶向損傷。但是有一半以上的治療患者卻可以避免上述腫瘤毒性，提示靶向共享抗原時(shí)，有效性與毒性之間的界線可能很狹窄。此外上述兩個(gè)TCRs療法伴隨著致死性神經(jīng)和心臟毒性，與癌睪丸抗原MAGE-A3直接相關(guān)，這也進(jìn)一步突出了面臨的挑戰(zhàn)。
然而目前正在進(jìn)行晚期臨床評(píng)價(jià)的NY-ESO-1T細(xì)胞療法(NCT01343043)似乎帶來(lái)了新的希望。癌睪丸抗原NY-ESO-1靶向表達(dá)T細(xì)胞則表現(xiàn)出更高的TCR親和力，特別是對(duì)HLA-A2限制肽，并且臨床療效明顯，無(wú)毒性反應(yīng)。這讓我們重新燃起了希望—對(duì)于所有共享抗原靶點(diǎn)，治療窗口可能并不那么狹窄。開發(fā)具有特定腫瘤新抗原特異性的TCRT細(xì)胞療法，可能比共享抗原的安全性更高，但是臨床上并未進(jìn)行驗(yàn)證。
2.CAR療法
CAR結(jié)合抗原結(jié)合域通常是來(lái)源于具有TCRζ鏈信號(hào)區(qū)域和包含如CD28、OX40和CD137等受體的附加共刺激區(qū)域的抗體的可變域的單鏈可變片段(scFv)。CARs克服了TCRs的一些限制，如需要MHC的表達(dá)、識(shí)別和共刺激等。CAR獨(dú)立于MHC識(shí)別限制的特性賦予了CART細(xì)胞抗腫瘤的有利基礎(chǔ)，因?yàn)榇蟛糠值哪[瘤免疫逃逸機(jī)制均表明腫瘤細(xì)胞已經(jīng)失去了MHC-相關(guān)的抗原提呈。當(dāng)前CART細(xì)胞療法的一個(gè)限制就是它們需要識(shí)別腫瘤細(xì)胞的外表面靶點(diǎn)。
B細(xì)胞惡性腫瘤—CART細(xì)胞的意外收獲
在第一代CAR設(shè)計(jì)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)中，對(duì)于多種腫瘤的治療結(jié)果均令人失望。2011年，第二代CART細(xì)胞靶向CD19和編碼共刺激結(jié)構(gòu)域成為了T細(xì)胞基因改造方法治療腫瘤的模板。其特征使得CD19成為幾乎理想的靶標(biāo)。它顯示出在B細(xì)胞惡性腫瘤中的常見性和高水平表達(dá)，而且需要人體正常B細(xì)胞的
發(fā)育，但是不表達(dá)B細(xì)胞系以外的細(xì)胞譜。采用CD19CARs成功治療的患者通常表現(xiàn)出顯著的B細(xì)胞發(fā)育不良，因此CART細(xì)胞治療后的B細(xì)胞缺失，主要通過(guò)靜脈注射免疫
球蛋白的替代療法進(jìn)行改善。
早期關(guān)于CART細(xì)胞作用于其它靶點(diǎn)的試驗(yàn)結(jié)果表明，CD19引發(fā)的非腫瘤交叉反應(yīng)并非特例，但是可能在其它同系靶點(diǎn)中也觀察到相同反應(yīng)。例如多發(fā)性骨髓瘤表達(dá)低水平CD19，采用CD19CART細(xì)胞治療也有效。正在進(jìn)行的CARs靶向B細(xì)胞成熟抗原(BCMA或CD269)的晚期骨肉瘤臨床試驗(yàn)(NCT02546167)中，除了惡性骨肉瘤細(xì)胞外，表達(dá)BCMA的良性漿細(xì)胞也被清除。非腫瘤反應(yīng)的耐受程度主要依賴于靶向非癌細(xì)胞的類型。通過(guò)CD19-特異CART細(xì)胞療法，大部分白血病復(fù)發(fā)患者達(dá)到完全治愈，但也出現(xiàn)了兩種耐受類型。一類是缺失CART細(xì)胞靶向CD19抗原表位的急性白血病，導(dǎo)致腫瘤逃逸。全球臨床試驗(yàn)中，CD-19陰性缺失變異的年輕和兒童急性白血病患者的復(fù)發(fā)率通常達(dá)到28%。另一類是慢性淋巴細(xì)胞(CLL)白血病，CLL的耐受可能是由于CART細(xì)胞注射后的增殖失敗。
CART在B細(xì)胞之外的應(yīng)用
現(xiàn)今CART的應(yīng)用已不僅僅局限于CD19。在早期靶向多發(fā)性骨肉瘤的BCMA和急性淋巴白血病的CD22的臨床試驗(yàn)中，CART細(xì)胞療法均表現(xiàn)出相似的抗腫瘤活性。然而，正如CD19對(duì)B細(xì)胞系一樣，BCMA和CD22也存在著高度限制，其存在的組織會(huì)出現(xiàn)靶向毒性。迄今為止，靶向腫瘤相關(guān)抗原的嘗試取得的成功十分有限。
ERBB2/HER2蛋白作為酪氨酸激酶受體一員，在腫瘤中經(jīng)常過(guò)表達(dá)，也是抗體或抗體-藥物偶聯(lián)治療的確證靶點(diǎn)。首次采用CART細(xì)胞靶向治療ERBB2/HER2患者時(shí)出現(xiàn)了致命性的毒性。通過(guò)使用具有基于赫賽汀和CD28和4-1BB細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的高親和力scFV的第三代CAR，揭示出毒性主要是由于識(shí)別和殺死肺上皮細(xì)胞表達(dá)低密度的ERBB2陽(yáng)性細(xì)胞所致，引發(fā)肺衰竭和大量細(xì)胞因子釋放。含有scFv的較低劑量CART細(xì)胞療法較赫賽汀為基礎(chǔ)建立的CAR的親和力更低，治療骨肉瘤的安全性較好，但只有輕度的臨床活性。
靶向表達(dá)腎細(xì)胞癌碳酸酐酶IX(CAIX)抗原的第一代CART細(xì)胞療法在I期臨床試驗(yàn)中也遇到了意想不到的肝毒性。原因是由于正常膽道上皮細(xì)胞CAIX抗原的低密度表達(dá)，并且在非臨床試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)該毒性。研究進(jìn)一步表明該療法具有潛在的腫瘤抗原相關(guān)的靶向非腫瘤毒性。
在臨床試驗(yàn)中，CARs靶向其它共享抗原相關(guān)實(shí)體瘤包括間皮素、癌胚抗原和GD2神經(jīng)節(jié)苷脂時(shí)并未顯示出值得關(guān)注的毒性，但試驗(yàn)中的臨床抗腫瘤療效也被限制到最低。GD2-特異CART細(xì)胞在臨床前試驗(yàn)中隨著抗腫瘤活性的增強(qiáng)出現(xiàn)致死性神經(jīng)毒性。局部注射靶向白介素-13受體α2的CART細(xì)胞治療多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤時(shí)未出現(xiàn)靜脈注射的預(yù)期毒性，表明需要關(guān)注一些抗原瘤內(nèi)注射給藥方式。
腫瘤微環(huán)境是ACT成功治療的另一障礙，特別是實(shí)體瘤。抑制T細(xì)胞免疫的途徑，包括腫瘤免疫檢查點(diǎn)(如PD-L1的表達(dá))，改變腫瘤代謝微環(huán)境(如缺氧或吲哚胺-1-氧化酶和精氨酸酶的表達(dá))，調(diào)節(jié)T細(xì)胞和抑制髓樣細(xì)胞。ACT治療后出現(xiàn)許多免疫和代謝檢查點(diǎn)增加，顯現(xiàn)出一定的耐受性。
聯(lián)合PD-1/PD-L1-抑制抗體和CD19特異CART細(xì)胞治療的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行(如NCT02926833，NCT02650999和NCT02706405)。除了聯(lián)合其他的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，另一種治療方式，中斷抑制途徑如轉(zhuǎn)染受體或剪切基因也正在進(jìn)行。
CART細(xì)胞療法的毒性
盡管ACT激活T細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致一定程度的免疫刺激和炎癥，但是CD-19特異性，BCMA特異性和CD-22特異性CART細(xì)胞均觀察到嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放并發(fā)癥(CRS)。該癥狀較TIL-和TCR療法常見的流行性感冒樣并發(fā)癥更加嚴(yán)重。CART細(xì)胞引發(fā)的CRS嚴(yán)重程度與腫瘤負(fù)擔(dān)相關(guān)。在大部分嚴(yán)重型患者中，CRS多數(shù)表現(xiàn)為嗜血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥和巨噬細(xì)胞活化綜合征的特征。
圖2CART細(xì)胞治療伴隨細(xì)胞因子釋放并發(fā)癥和神經(jīng)毒性(圖片來(lái)源于參考文獻(xiàn))
盡管CRS是T細(xì)胞免疫療法的預(yù)期毒性，但是在臨床試驗(yàn)中仍觀察到CD19和BCMA特異性CART細(xì)胞治療中出現(xiàn)的輕度到重度的
神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。發(fā)生T細(xì)胞免疫療法介導(dǎo)的CRS和腦水腫的作用機(jī)制仍不太明確，部分原因是因?yàn)槿鄙儆姓f(shuō)服力的動(dòng)物模型來(lái)探討重要毒性的發(fā)生機(jī)制。
通過(guò)基因工程完善T細(xì)胞基因改造
與TCRs相似，親和力改變也適用于CAR的設(shè)計(jì)中，以便增加CART細(xì)胞潛在的抗腫瘤能力和調(diào)節(jié)靶點(diǎn)的非腫瘤毒性。然而，選擇最佳的親和力也是需要反復(fù)調(diào)整的，例如臨床前試驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻骺鼓[瘤活性的改善(但是出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)毒性)與增強(qiáng)GD2-特異CAR結(jié)合力密切相關(guān)。
除了親和力，最重要的還要評(píng)價(jià)CAR的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和信號(hào)傳導(dǎo)這些能改變CAR功能的影響因素。但不幸的是，幾乎沒(méi)有限定的標(biāo)準(zhǔn)可尋，CAR的設(shè)計(jì)絕大部分仍然是經(jīng)驗(yàn)性的。許多案例顯示，在非臨床試驗(yàn)中不能完全體現(xiàn)出所有的有效性和安全性，這就使得CAR的設(shè)計(jì)更加復(fù)雜化。
通用型CART細(xì)胞
盡管ACT是從異基因骨髓移植演變而來(lái)。但由于MHC所固有的障礙，ACT策略集中于自體T細(xì)胞。如果MHC的屏障清除，那么異體捐獻(xiàn)或“通用型”T細(xì)胞會(huì)較自體T細(xì)胞更能發(fā)揮更好的療效。源自健康供體的通用型CART細(xì)胞具有克服與腫瘤治療相關(guān)的免疫缺陷的潛力。此外，通用CART細(xì)胞療法的使用可能為簡(jiǎn)化工程細(xì)胞制造提供了機(jī)會(huì)，甚至允許生產(chǎn)“現(xiàn)成”ACT產(chǎn)品。與自體患者特異性T細(xì)胞相比，促進(jìn)更快速和更便宜的治療。
然而，主要的問(wèn)題仍然是該方法是否能單用發(fā)揮療效，或僅作為現(xiàn)今確證療法如
干細(xì)胞移植或者自體CART細(xì)胞治療的橋接作用。
基因編輯和多功能CARs
多種方法均能靶向破壞DNA雙鏈，達(dá)到插入或切除突變位點(diǎn)，使靶基因失活的作用。同源直接修復(fù)可用于在靶位點(diǎn)插入目標(biāo)基因。有許多基因編碼工具，包括鋅指核酸酶、大范圍核酸酶、TALENs、復(fù)位內(nèi)切核酸酶及CRISPR-Cas9核酸酶。這些技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于T細(xì)胞工程?，F(xiàn)在該領(lǐng)域的主要問(wèn)題是細(xì)菌衍生的Cas9是否具有足夠的免疫原性以干擾CRISPR-Cas9編輯的T細(xì)胞遞送。
人類基因編碼給清除免疫抑制提供了機(jī)遇，例如能清除CTLA-4和PD-1等的免疫抑制，增強(qiáng)T細(xì)胞功能，并可以避免免疫檢查點(diǎn)相關(guān)的毒性反應(yīng)。基因編碼也被用于清除CAR的靶向基因，可能有利于靶向腫瘤相關(guān)抗原，有利于T細(xì)胞的腫瘤免疫。
CART細(xì)胞的商業(yè)化
在過(guò)去幾十年里，腫瘤免疫領(lǐng)域作為一個(gè)成功的故事被廣泛關(guān)注。然而，大多數(shù)通常都是非治愈的靶向治療，能夠延長(zhǎng)生病和增加癌癥患者的生存率。現(xiàn)在有250多項(xiàng)CART臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。值得關(guān)注的是，這些臨床試驗(yàn)存在地域差異，熱衷于該研究的區(qū)域主要有中國(guó)、美國(guó)，較少的試驗(yàn)在歐洲、日本和南半球(圖4)展開。
對(duì)于有夠有效治療但不能治愈的血液惡性疾病，特別是慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)和多發(fā)性骨髓瘤，患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)在明顯增加。美國(guó)最常見的白血病CLL，在2000年時(shí)大約有10萬(wàn)例患者，由于使用改善但不能治愈的靶向療法，例如Ibrutinib和Idelalisib，預(yù)計(jì)美國(guó)將增加至約20萬(wàn)例患者。靶向治療CLL目前不但對(duì)個(gè)人，而且對(duì)整個(gè)社會(huì)經(jīng)濟(jì)都已成為重要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。現(xiàn)在估計(jì)每例患者整個(gè)生命周期約花費(fèi)60萬(wàn)美元，到2025年美國(guó)僅CLL治療整體花費(fèi)將超過(guò)50億美元。CART細(xì)胞療法較現(xiàn)今的標(biāo)準(zhǔn)治療白血病和淋巴癌的方法花費(fèi)更高。生產(chǎn)的高度個(gè)性化T細(xì)胞需要更大的費(fèi)用，因此迫切期待降低CART細(xì)胞的生產(chǎn)成本。
未來(lái)的機(jī)遇和應(yīng)用
我們值得從多個(gè)角度關(guān)注治療白血病和淋巴癌的CART細(xì)胞療法，更重要的是CART細(xì)胞療法是美國(guó)FDA首次批準(zhǔn)的商業(yè)化基因轉(zhuǎn)染療法。由于CART細(xì)胞具有CRS風(fēng)險(xiǎn)和神經(jīng)毒性，需要隨時(shí)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和處置方案設(shè)計(jì)，因此FDA要求醫(yī)師完成不良反應(yīng)處置的培訓(xùn)。
開發(fā)細(xì)胞療法的最大挑戰(zhàn)是，由于缺乏非臨床試驗(yàn)資料，導(dǎo)致不能有效評(píng)估項(xiàng)目的安全性和有效性，不能預(yù)見早期臨床試驗(yàn)中可能遇到的安全性問(wèn)題。盡管CART細(xì)胞療法對(duì)于治療血液惡性腫瘤的表現(xiàn)良好，但在實(shí)體瘤治療中仍存在許多障礙。
CART研究中的T細(xì)胞設(shè)計(jì)、基因編碼和細(xì)胞生產(chǎn)都是T細(xì)胞療法潛在的負(fù)擔(dān)。采用T細(xì)胞方法作用于其它細(xì)胞對(duì)于腫瘤免疫以外的其它疾病，如感染、器官移植和自身免疫疾病均有廣闊的研發(fā)前景。
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