丙型肝炎(丙肝)是由丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)引起的一種肝臟疾病。該病毒可造成急性或慢性肝炎，其嚴(yán)重程度從持續(xù)幾周的輕微病癥到終身嚴(yán)重疾病不等。急性丙肝病毒感染通常沒有癥狀，且僅在十分罕見情況下才會導(dǎo)致危及生命的疾病，約有15%-45%的感染者不經(jīng)任何治療即可在感染6個月之內(nèi)自行清除病毒。其余55%–85%的感染者會發(fā)生慢性丙肝病毒感染。在這些慢性丙肝病毒感染者中，20年內(nèi)出現(xiàn)肝硬化的危險為15%–30%。全球預(yù)計有7100萬人受到慢性丙肝感染。90年代中期，學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界為開發(fā)丙肝病毒蛋白酶抑制劑付出了大量的努力。然而，這項任務(wù)遭遇了很多具有挑戰(zhàn)性的障礙：①丙型肝炎病毒生命周期尚未完全確定；②缺乏細(xì)胞評價模型和驗證HCV蛋白酶抑制劑作用機(jī)制的方法；③缺乏臨床前藥物評價的動物模型。十幾年來，用來發(fā)現(xiàn)和開發(fā)HCV治療藥物的必要工具發(fā)展了起來。

　　與其他慢性病毒性感染(如乙型肝炎病毒或艾滋病毒)不同，丙型肝炎治療后能很好地清除復(fù)制期HCV并控制肝損傷的進(jìn)展。HCV治療最初依賴于免疫刺激干擾素-α(IFN-α)，隨后通過在每日的劑量中加入核苷類似物利巴韋林并結(jié)合聚乙二醇干擾素-α(PEG-IFN-α)來改善治療，從而減少了蛋白質(zhì)的給藥頻率，變?yōu)槊恐芷は伦⑸湟淮?。這種治療組合提高了持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，當(dāng)僅用IFN-α治療時，SVR<20%，而用最優(yōu)化組合治療時SVR達(dá)到40–55%。

　　1989年，HCV的分子克隆幫助闡明了基因結(jié)構(gòu)和參與復(fù)制的關(guān)鍵酶的特性，使有效抑制劑的確認(rèn)達(dá)到新階段。HCV最初是通過重組技術(shù)從受感染者血清中得到的多肽，繼而用非甲非乙肝炎患者血清對其檢測而鑒定出。這一方法促使人們分離出HCV基因組片段，之后，完整的HCV基因組被測序鑒定。

　　HCV屬于黃病毒科家族中的一員，其基因組基因編碼一條大約由3000多個氨基酸殘基組成的多蛋白前體(polyprotein)。該多蛋白前體在宿主細(xì)胞中被剪切產(chǎn)生3個結(jié)構(gòu)蛋白(proteincore，E1和E2)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。非結(jié)構(gòu)性蛋白組裝成多蛋白復(fù)制酶復(fù)合體，后者負(fù)責(zé)復(fù)制產(chǎn)生HCVRNA。丙型肝炎病毒生命周期中的最終步驟是將HCVRNA包裝并成熟為感染性病毒，最終釋放到血液中。

　　HCV非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)是N末端181-氨基酸部分中具有催化絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的631-氨基酸雙功能蛋白，C-末端部分具有解旋酶結(jié)構(gòu)域。NS3與NS4A(一種54-氨基酸輔因子)緊密結(jié)合，形成NS3·4A復(fù)合物。無論NS4A是否存在的情況下，對NS3催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行檢查表明，NS4A深埋在NS3的核心，有助于組織酶的活性位點。天然NS3·4A復(fù)合物的催化效率高于NS3蛋白酶N末端結(jié)構(gòu)域一個數(shù)量級。NS3·4A蛋白酶負(fù)責(zé)NS4-NS4A，NS4A-NS4B，NS4B-NS5A和NS5A-NS5B之間的病毒多聚蛋白的切割，以釋放HCV復(fù)制酶的組分，并且該酶已被證明是病毒復(fù)制所必需的。

　　因此，針對NS3·4A小分子抑制劑的藥物發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成為制藥行業(yè)極為關(guān)注的焦點。VertexPharmaceuticals于1997年與EliLilly合作，進(jìn)入HCV藥物開發(fā)領(lǐng)域，利用VertexPharmaceuticals在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計中的核心實力，解決了該疾病的高度未滿足的醫(yī)療需求。

　　發(fā)現(xiàn)

　　VertexPharmaceuticals在開始該項目的初期，決定尋找優(yōu)先分布到肝臟的化合物，因為該器官是身體發(fā)生HCV復(fù)制的主要部位。由于缺乏高通量篩選工作的苗頭化合物，VertexPharmaceuticals決定將衍生自NS3·4A蛋白酶的天然NS5A-NS5B底物十肽1(Ki=0.89uM)用于抑制劑優(yōu)化的起始點。該十肽跨越酶結(jié)合位點的S6至S4'位點。

　　早期的工作集中在尋找能提供足夠結(jié)合親和力的最佳抑制劑大小和分子量范圍。對底物的截斷研究表明，去除P4'氨基酸導(dǎo)致顯著的活性損失，但是在P2'和P3'處的截斷對酶親和力幾乎沒有負(fù)面影響。此外，除去P5和P6上的酸性殘基導(dǎo)致顯著的活性損失。此外，P3和P4疏水性殘基的去除也會造成酶親和力的下降。這表明，在這些位點處的酶和抑制劑之間產(chǎn)生疏水相互作用。

　　學(xué)界對通過共價可逆抑制劑抑制絲氨酸蛋白酶如HCV蛋白酶展開了大量研究。通過絲氨酸殘基與抑制劑C末端親電子部分形成可逆共價鍵，得到的酶抑制劑復(fù)合物是模擬酰胺鍵水解的過渡狀態(tài)四面體中間體，并且通過幾種離子相互作用而穩(wěn)定。因此，共價可逆抑制劑已顯示出比依賴于離子相互作用的抑制劑更有效，研究人員決定尋找跨越S4至S1'位點的共價可逆抑制劑。最初，研究人員決定選擇醛類官能團(tuán)為替代物，如六肽醛2(Ki=0.89μM)。將雜環(huán)化合物代替P6和P5殘基，得到的四肽醛3(Ki=12μM)作為進(jìn)一步優(yōu)化的起點。

　　隨后，研究人員對四肽醛的幾個區(qū)域依次或平行進(jìn)行優(yōu)化。早期優(yōu)化集中在P2殘基上，對疏水部分的優(yōu)化可能導(dǎo)致抑制劑親和力的增加。由于原料4-羥基脯氨酸可以大批量的購買，VertexPharmaceuticals制備了脯氨酸4位是醚，酯和氨基甲酸酯取代的化合物，如4，5和6。然而，這些化合物都太容易水解。

　　由于醛類結(jié)構(gòu)在藥物中表現(xiàn)不佳，并且在體內(nèi)容易氧化成羧酸，研究人員試圖對此進(jìn)行優(yōu)化。在嘗試了許多通常用于絲氨酸蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)(如羧酸，三氟甲基酮，氯甲基酮等)，均沒有成功。最終發(fā)現(xiàn)，α-酮酰胺替換醛類結(jié)構(gòu)，可以使其親和力提高了40倍。通過在側(cè)鏈引入羧基可以獲得更好的親和力(如8，Ki=26nM)。小的脂族基團(tuán)如環(huán)丙基(9)在酶和細(xì)胞試驗中也顯示出令人鼓舞的活性。可能是由于羧基的帶電特性，阻止細(xì)胞膜滲透，化合物8在復(fù)制子測定試驗(therepliconassay)中沒有表現(xiàn)出活性。

　　VertexPharmaceuticals對四氫異喹啉基(THIQ)氨基甲酸酯脯氨酸α-酮酰胺亞類的優(yōu)化花費了相當(dāng)多的精力和時間，制備了超過300種化合物。然而，大多數(shù)化合物顯示出較差的藥代動力學(xué)(PK)性質(zhì)，并且在小鼠中單次口服給藥時觀察到較低的肝和血漿暴露，可能是因為P2殘基的大尺寸而具有差的物理化學(xué)性質(zhì)。此時，研究人員對化合物10的晶體結(jié)構(gòu)復(fù)查，認(rèn)為在脯氨酸基的α面上3位具有1至4個碳取代基可導(dǎo)致酶活性位點中假定的水分子發(fā)生置換，從而改善結(jié)合親和力。為檢驗這個推論，研究人員制備了化合物11并顯示出較好的活性(Ki=1.4μM)。隨后的晶體結(jié)構(gòu)驗證了水分子置換假說，研究人員對具有該取代模式的P2展開了進(jìn)一步的探索。此外，基于3-烷基脯氨酸抑制劑顯示較好的PK性質(zhì)，在小鼠中單次口服給藥后導(dǎo)致肝臟暴露顯著改善，為進(jìn)一步優(yōu)化提供了動力。將甲基取代基延伸至乙基，最終演化得到雙環(huán)酮14(Ki=40nM)。將酮類結(jié)構(gòu)還原成雙環(huán)碳環(huán)，加上在P1'，P1，P3和P4的進(jìn)一步優(yōu)化，研究人員發(fā)現(xiàn)了特拉匹韋(telaprevir)?；谄浠钚院驮趪X動物中良好的肝臟暴露，選擇特拉匹韋進(jìn)行下一步的研究。

　　由于這些化合物的分子量較高和水溶性較低，肽模擬物的藥代動力學(xué)可能不理想。如下表所示，試驗數(shù)據(jù)顯示，對大鼠和犬靜脈給藥，特拉匹韋(telaprevir)具有較高的清除率，但組織分布良好，并具有很好的口服暴露量。

　　丙型肝炎是肝臟的一種疾病，大多數(shù)HCV復(fù)制發(fā)生在肝臟，所以，選擇HCV蛋白酶抑制劑作為臨床前候選者的標(biāo)準(zhǔn)之一是其分配到肝臟的能力。與其他近似類似物相比，特拉匹韋(telaprevir)的表現(xiàn)特別好。對于特拉匹韋(telaprevir)，在施用單次30mg/kg口服劑量后，在8小時的時間過程中，大鼠的平均肝-血漿比被確定為35。在該劑量下，肝臟中的特拉匹韋(telaprevir)暴露約為14μM，比復(fù)制子細(xì)胞(repliconcells)中48小時的IC50高30倍。特拉匹韋(telaprevir)在小鼠模型中也具有類似的肝臟分布。這是選擇特拉匹韋(telaprevir)作為臨床候選藥物的關(guān)鍵因素。

　　特拉匹韋(telaprevir)和NS3·4A復(fù)合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析出來。特拉匹韋(telaprevir)與丙肝病毒NS3·4A蛋白酶通過Ser139羥基與特拉匹韋(telaprevir)酰胺之間的可逆共價鍵形成一個緊密的復(fù)合物。此外，氨基酸Gly137和Ser139的NH與的特拉匹韋(telaprevir)酰胺羰基之間形成兩個氫鍵。特拉匹韋(telaprevir)和蛋白酶骨架形成氫鍵，如P1的NH和Arg155的羰基氧，P3羰基氧與Ala157的NH，P3的NH與Ala157的羰基氧和吡嗪的羰基與Ser159的OH和NH之間。

　　合成

　　特拉匹韋(telaprevir)的逆合成如下圖所示，P1和P2之間首先斷開產(chǎn)生16和三肽15，三肽15由關(guān)鍵的雙環(huán)P2支架17和叔丁基甘氨酸P3，環(huán)己基甘氨酸P4和2-吡嗪羧酸合成得到，以使合成期間氨基酸立體中心的差向異構(gòu)化能達(dá)到最小化。

　　化合物16有多種制備方法，但是以下兩條路線能有效的減少合成步驟和保持其對映異構(gòu)體純度。路線1A是α-氨基醛與異氰通過Passerini反應(yīng)，脫Cbz后得到化合物16；路線1B則是通過α-氨基酸增碳后得到關(guān)鍵中間體19，?；蟮玫交衔?6。不過路線1A中使用了易揮發(fā)的有毒物質(zhì)異氰18，不適合工業(yè)放大。

　　化合物17的合成是特拉匹韋(telaprevir)制備方法中的難點，有三種制備方法。第一種合成方法是通過從噻唑鎓葉立德20與2-環(huán)戊烯酮的環(huán)加成得到四環(huán)非對映異構(gòu)體21，脫保護(hù)后得到22，對其手性拆分，隨后酮羰基還原和脫保護(hù)基，最終得到關(guān)鍵的化合物17，并可以達(dá)到百克級的制備。

　　由于第一條合成路線較長，使用有毒的錫試劑以及手性拆分，不適合進(jìn)一步放大。為此研究人員開發(fā)了一種改進(jìn)的六步合成路線，以規(guī)避手性拆分步驟，并使得能夠生產(chǎn)近100kg的化合物17。(1S)-(-)樟腦和叔丁基甘氨酸酯得到亞胺23，亞胺23與環(huán)戊烯甲酸甲酯24通過Michael加成，得到作為單一非對映異構(gòu)體的邁克爾加合物25。亞胺25水解，環(huán)化產(chǎn)生內(nèi)酰胺酯26，隨后Boc保護(hù)，內(nèi)酰胺還原和脫保護(hù)得到雙環(huán)脯氨酸17。

　　為了避免一些昂貴的非天然樟腦手性助劑及其回收，研究人員開發(fā)了第三條路線，用于大規(guī)模反應(yīng)生產(chǎn)的P2合成物19(>100公斤)。采用非常廉價的3-氮雜雙環(huán)[3.3.0]辛烷鹽酸鹽27作為原料，經(jīng)Boc保護(hù)，堿拔氫后，在平衡條件下用二氧化碳捕獲陰離子，然后很好的非對映選擇性產(chǎn)生所需的外消旋體29。29通過與光學(xué)活性堿(S)-1,2,3,4-四氫-1-萘基銨鹽形成以高產(chǎn)率和高對映異構(gòu)體形成鹽30，中和，酯化后得到雙環(huán)脯氨酸17。

　　關(guān)鍵中間體16和17的大量制備為特拉匹韋(telaprevir)的生產(chǎn)打下了堅實的基礎(chǔ)。Cbz保護(hù)的叔丁基甘氨酸與雙環(huán)脯氨酸酯17在標(biāo)準(zhǔn)條件下反應(yīng)得到二肽31。脫去保護(hù)基后，與Cbz保護(hù)的環(huán)己基甘氨酸偶聯(lián)得到三肽32。對32進(jìn)行脫保護(hù)，然后與吡嗪羧酸的偶聯(lián)得到三肽酸前體15。使用N-甲基嗎啉作為堿，16和三肽15反應(yīng)得到羥基酰胺前體33?；衔?3經(jīng)Dess-Martin氧化，以良好的產(chǎn)率得到特拉匹韋(telaprevir)。

　　總結(jié)

　　毋庸置疑，特拉匹韋(telaprevir)的成功開發(fā)主要依賴于對疾病相關(guān)酶靶標(biāo)以及其酶家族結(jié)構(gòu)的認(rèn)識和解析。隨著技術(shù)的日益進(jìn)步和人類對疾病機(jī)制以及蛋白結(jié)構(gòu)等知識的不斷增長，基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計策略在藥物研發(fā)領(lǐng)域，尤其是先導(dǎo)化合物和藥物設(shè)計過程中得到更廣泛的應(yīng)用。

　　2014年8月Vertex正式宣布，因銷量持續(xù)下滑以及丙肝藥物市場的激烈競爭，自2014年10月16日起，該公司不再繼續(xù)在美國市場銷售該藥物。雖然特拉匹韋(telaprevir)已經(jīng)撤市，但其研發(fā)歷程對后續(xù)藥物的開發(fā)有著重要的借鑒作用。