貝利木單抗誕生記

　　貝利木單抗2011年獲得FDA批準(zhǔn)，用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，簡(jiǎn)稱SLE），成為56年來(lái)首個(gè)用于SLE的新藥。作為基因組學(xué)研究催生的少數(shù)新靶點(diǎn)藥物之一，貝利木單抗的研發(fā)過(guò)程同樣具有重要的借鑒意義，本文將介紹貝利木單抗誕生的故事。

　　正如前文所述（系統(tǒng)性紅斑狼瘡研究史），系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種極為復(fù)雜的自身免疫病疾病，患者體內(nèi)B細(xì)胞過(guò)度活化，產(chǎn)生大量自身抗體，抗原抗體復(fù)合物被補(bǔ)體識(shí)別，啟動(dòng)補(bǔ)體途徑，攻擊自身組織，導(dǎo)致多器官、組織的損傷。

　　HGS：基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)SLE潛在治療靶點(diǎn)BLyS

　　B細(xì)胞活化因子是一種天然蛋白，1999年5月由美國(guó)國(guó)立猶太醫(yī)學(xué)中心和科羅拉多大學(xué)的研究人員合作發(fā)現(xiàn)，并命名為T(mén)ALL-1。1999年6月，另一篇文獻(xiàn)中將該蛋白命名為BAFF，1999年7月，Human Genome Sciences（簡(jiǎn)稱HGS）公司的研究人員在文獻(xiàn)中將該蛋白稱為BLyS（B lymphocyte stimulator）。

　　HGS是一家專注mRNA研究的生物技術(shù)公司，他們發(fā)現(xiàn)BLyS在PBMC和淋巴結(jié)、脾臟等淋巴組織中高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)BLyS是一種B細(xì)胞刺激因子。HGS經(jīng)過(guò)分析，認(rèn)為BLyS可以作為自身免疫病如RA、SLE的潛在治療靶點(diǎn)。

　　2000年10月，HGS與劍橋抗體技術(shù)公司（Cambridge Antibody Technique，簡(jiǎn)稱CAT）簽訂合作協(xié)議，共同開(kāi)發(fā)靶向BLyS的抗體。根據(jù)協(xié)議，CAT負(fù)責(zé)抗體的篩選，HGS選擇合適的候選抗體進(jìn)行臨床研究。

　　CAT：篩選1287種抗體

　　2003年，CAT發(fā)表了一篇文獻(xiàn)，CAT通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選了超過(guò)1000種抗體，其中超過(guò)半數(shù)可以阻止BLyS與受體結(jié)合。

　　CAT篩選此次篩選BLyS抗體的抗體庫(kù)來(lái)自80個(gè)人的可變區(qū)重排，容量為1010~1011。CAT提供進(jìn)行了4種方法、2-5輪篩選，第一輪“淘洗”后，有幾千個(gè)被篩選出來(lái)。從第二輪開(kāi)始，采用噬菌體ELISA進(jìn)行篩選，BLyS被包被到板子上，然后篩選可以結(jié)合BLyS的抗體（噬菌體上的scFv）。CAT共篩選了7000多個(gè)（81塊96孔板）克隆，其中有2875（39%）個(gè)可以結(jié)合BLyS。

　　這2875個(gè)抗體的DNA序列都被確定，去除重疊（相同序列的克?。┖?，確認(rèn)有1287個(gè)抗體，涵蓋了1098個(gè)VH序列和705個(gè)VL序列。

　　篩選出來(lái)的抗體panel多樣性可通過(guò)與VH、VL、D、J數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)42/49個(gè)VH、24/27個(gè)D、6/6個(gè)JH域出現(xiàn)在panel中，輕鏈可變區(qū)多樣性不如重鏈但仍極為可觀：19/33個(gè)Vλ、13/35個(gè)Vк、3/7個(gè)Jλ、4/5個(gè)Jк出現(xiàn)在Panel中。

　　通過(guò)噬菌體ELISA確認(rèn)了1287個(gè)可以結(jié)合BLyS的抗體，CAT隨后用生化方法來(lái)檢測(cè)這些抗體能否拮抗BLyS與其B細(xì)胞受體的結(jié)合（細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有500個(gè)抗體可以拮抗BLyS與受體的結(jié)合：100個(gè)抗體可以拮抗80%的結(jié)合、200個(gè)抗體可以拮抗60%-80%的結(jié)合、200個(gè)抗體可以拮抗40%-60%的結(jié)合。

　　CAT從拮抗BLyS與受體結(jié)合80%以上的抗體中選取了33個(gè)進(jìn)行純化，得到純品并測(cè)定與BLyS結(jié)合的IC50值，結(jié)果在9nM-420nM之間。

　　CAT選取了5個(gè)抗體，把scFv形式轉(zhuǎn)為IgG形式，其中有3個(gè)（AB-3、AB-7、AB-12）的效價(jià)有所提高，另外兩個(gè)AB-1、AB-2的效價(jià)則略有下降。

　　CAT的前期篩選非常充分，為確認(rèn)候選抗體做好了準(zhǔn)備工作。

　　HGS：確認(rèn)候選抗體

　　2003年晚些時(shí)候，HGS發(fā)表了一篇文獻(xiàn)，從CAT篩選的抗體庫(kù)中，確認(rèn)了一種候選抗體lymphoStat-B，也就是后來(lái)的貝利木單抗。

　　HGS首先選取了6個(gè)親和力高的scFv，將其轉(zhuǎn)為IgG形式，顯示hBLySmAb-1、hBLySmAb-2有最強(qiáng)的抑制效果。由此確定了2個(gè)候選scFv，接下來(lái)HGS對(duì)這2個(gè)scFv進(jìn)行親和力成熟改造：對(duì)這2個(gè)scFv的VH CDR3末端6個(gè)氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選出對(duì)應(yīng)的親和力更強(qiáng)的scFv。

　　HGS由此確定了2個(gè)候選scFv：hBLySsc-1.and hBLySsc-2,，接下來(lái)HGS對(duì)這2個(gè)scFv進(jìn)行親和力成熟改造：對(duì)這2個(gè)scFv的VH CDR3末端6個(gè)氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選出對(duì)應(yīng)的親和力更強(qiáng)的scFv，即hBLySsc-1.1（IC50為0.7nM，比hBLySsc-1高10倍）和 hBLySsc-2.1（IC50為0.2nM，比hBLySsc-1高20倍）。

　　HGS將親和力改造的scFv庫(kù)中選取親和力最高的30幾個(gè)scFv都轉(zhuǎn)為IgG形式，再次測(cè)定親和力。hBLySsc-1.1轉(zhuǎn)為IgG后的hBLySmAb-1.1具有最強(qiáng)的活性，成為候選藥物，命名為L(zhǎng)ymphoStat-B（即貝利木單抗）。

　　HGS對(duì)LymphoStat-B進(jìn)行了一系列體內(nèi)體外試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LymphoStat-B對(duì)BLyS有高親和力，如能導(dǎo)致食蟹猴脾臟和淋巴結(jié)的B細(xì)胞衰竭。證實(shí)LymphoStat-B具有治療自身免疫病的潛力。之后HGS便加緊推進(jìn)LymphoStat-B的RA、SLE適應(yīng)癥的臨床研究，其中RA適應(yīng)癥在II期失敗，SLE則繼續(xù)前行。

　　歷經(jīng)曲折終上市

　　2006年8月，HGS與葛蘭素史克簽訂合作協(xié)議，葛蘭素史克協(xié)助HGS完成貝利木單抗的三期臨床研究，兩家企業(yè)平均分擔(dān)后期研發(fā)費(fèi)用，平分商業(yè)利潤(rùn)。

　　2011年3月9日，F(xiàn)DA正式批準(zhǔn)貝利木單抗用于治療SLE，商品名為Benlysta。2012年8月，葛蘭素史克完成對(duì)HGS的收購(gòu)，Benlysta成為葛蘭素史克旗下產(chǎn)品。

　　值得一提的是，貝利木單抗的臨床策略起到了至關(guān)重要的作用，因?yàn)樨惱締慰怪挥休p微的療效。而SLE作為一種復(fù)雜的自身免疫疾病，臨床上通常采用多藥聯(lián)合治療，如激素等，這會(huì)干擾SLE新藥的療效評(píng)估，也成為SLE新藥的最大瓶頸。貝利木單抗在二期臨床中同樣未表現(xiàn)顯著的療效，HGS在分析數(shù)據(jù)時(shí)沒(méi)有用常規(guī)的臨床癥狀重點(diǎn)，而是組合式的臨床終點(diǎn)。這時(shí)候，HGS和葛蘭素史克已經(jīng)意識(shí)到激素藥物會(huì)嚴(yán)重干擾貝利木單抗的療效評(píng)估，在隨后的三期臨床中，兩家公司嚴(yán)格限制只有服用低劑量潑尼松的患者入組，最大程度避免其他藥物的干擾。調(diào)整策略后，貝利木單抗的三期臨床獲得正面評(píng)價(jià)，雖然只有輕微療效，仍然成功獲得FDA批準(zhǔn)。

　　2016年，Benlysta銷售額為3.06億歐元。