貝利木單抗誕生記

　　貝利木單抗2011年獲得FDA批準，用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，簡稱SLE），成為56年來首個用于SLE的新藥。作為基因組學研究催生的少數(shù)新靶點藥物之一，貝利木單抗的研發(fā)過程同樣具有重要的借鑒意義，本文將介紹貝利木單抗誕生的故事。

　　正如前文所述（系統(tǒng)性紅斑狼瘡研究史），系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種極為復雜的自身免疫病疾病，患者體內(nèi)B細胞過度活化，產(chǎn)生大量自身抗體，抗原抗體復合物被補體識別，啟動補體途徑，攻擊自身組織，導致多器官、組織的損傷。

　　HGS：基因組學發(fā)現(xiàn)SLE潛在治療靶點BLyS

　　B細胞活化因子是一種天然蛋白，1999年5月由美國國立猶太醫(yī)學中心和科羅拉多大學的研究人員合作發(fā)現(xiàn)，并命名為TALL-1。1999年6月，另一篇文獻中將該蛋白命名為BAFF，1999年7月，Human Genome Sciences（簡稱HGS）公司的研究人員在文獻中將該蛋白稱為BLyS（B lymphocyte stimulator）。

　　HGS是一家專注mRNA研究的生物技術(shù)公司，他們發(fā)現(xiàn)BLyS在PBMC和淋巴結(jié)、脾臟等淋巴組織中高表達，并發(fā)現(xiàn)BLyS是一種B細胞刺激因子。HGS經(jīng)過分析，認為BLyS可以作為自身免疫病如RA、SLE的潛在治療靶點。

　　2000年10月，HGS與劍橋抗體技術(shù)公司（Cambridge Antibody Technique，簡稱CAT）簽訂合作協(xié)議，共同開發(fā)靶向BLyS的抗體。根據(jù)協(xié)議，CAT負責抗體的篩選，HGS選擇合適的候選抗體進行臨床研究。

　　CAT：篩選1287種抗體

　　2003年，CAT發(fā)表了一篇文獻，CAT通過噬菌體展示技術(shù)篩選了超過1000種抗體，其中超過半數(shù)可以阻止BLyS與受體結(jié)合。

　　CAT篩選此次篩選BLyS抗體的抗體庫來自80個人的可變區(qū)重排，容量為1010~1011。CAT提供進行了4種方法、2-5輪篩選，第一輪“淘洗”后，有幾千個被篩選出來。從第二輪開始，采用噬菌體ELISA進行篩選，BLyS被包被到板子上，然后篩選可以結(jié)合BLyS的抗體（噬菌體上的scFv）。CAT共篩選了7000多個（81塊96孔板）克隆，其中有2875（39%）個可以結(jié)合BLyS。

　　這2875個抗體的DNA序列都被確定，去除重疊（相同序列的克?。┖螅_認有1287個抗體，涵蓋了1098個VH序列和705個VL序列。

　　篩選出來的抗體panel多樣性可通過與VH、VL、D、J數(shù)據(jù)庫序列比對，發(fā)現(xiàn)42/49個VH、24/27個D、6/6個JH域出現(xiàn)在panel中，輕鏈可變區(qū)多樣性不如重鏈但仍極為可觀：19/33個Vλ、13/35個Vк、3/7個Jλ、4/5個Jк出現(xiàn)在Panel中。

　　通過噬菌體ELISA確認了1287個可以結(jié)合BLyS的抗體，CAT隨后用生化方法來檢測這些抗體能否拮抗BLyS與其B細胞受體的結(jié)合（細胞學實驗）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有500個抗體可以拮抗BLyS與受體的結(jié)合：100個抗體可以拮抗80%的結(jié)合、200個抗體可以拮抗60%-80%的結(jié)合、200個抗體可以拮抗40%-60%的結(jié)合。

　　CAT從拮抗BLyS與受體結(jié)合80%以上的抗體中選取了33個進行純化，得到純品并測定與BLyS結(jié)合的IC50值，結(jié)果在9nM-420nM之間。

　　CAT選取了5個抗體，把scFv形式轉(zhuǎn)為IgG形式，其中有3個（AB-3、AB-7、AB-12）的效價有所提高，另外兩個AB-1、AB-2的效價則略有下降。

　　CAT的前期篩選非常充分，為確認候選抗體做好了準備工作。

　　HGS：確認候選抗體

　　2003年晚些時候，HGS發(fā)表了一篇文獻，從CAT篩選的抗體庫中，確認了一種候選抗體lymphoStat-B，也就是后來的貝利木單抗。

　　HGS首先選取了6個親和力高的scFv，將其轉(zhuǎn)為IgG形式，顯示hBLySmAb-1、hBLySmAb-2有最強的抑制效果。由此確定了2個候選scFv，接下來HGS對這2個scFv進行親和力成熟改造：對這2個scFv的VH CDR3末端6個氨基酸進行隨機突變，篩選出對應(yīng)的親和力更強的scFv。

　　HGS由此確定了2個候選scFv：hBLySsc-1.and hBLySsc-2,，接下來HGS對這2個scFv進行親和力成熟改造：對這2個scFv的VH CDR3末端6個氨基酸進行隨機突變，篩選出對應(yīng)的親和力更強的scFv，即hBLySsc-1.1（IC50為0.7nM，比hBLySsc-1高10倍）和 hBLySsc-2.1（IC50為0.2nM，比hBLySsc-1高20倍）。

　　HGS將親和力改造的scFv庫中選取親和力最高的30幾個scFv都轉(zhuǎn)為IgG形式，再次測定親和力。hBLySsc-1.1轉(zhuǎn)為IgG后的hBLySmAb-1.1具有最強的活性，成為候選藥物，命名為LymphoStat-B（即貝利木單抗）。

　　HGS對LymphoStat-B進行了一系列體內(nèi)體外試驗，發(fā)現(xiàn)LymphoStat-B對BLyS有高親和力，如能導致食蟹猴脾臟和淋巴結(jié)的B細胞衰竭。證實LymphoStat-B具有治療自身免疫病的潛力。之后HGS便加緊推進LymphoStat-B的RA、SLE適應(yīng)癥的臨床研究，其中RA適應(yīng)癥在II期失敗，SLE則繼續(xù)前行。

　　歷經(jīng)曲折終上市

　　2006年8月，HGS與葛蘭素史克簽訂合作協(xié)議，葛蘭素史克協(xié)助HGS完成貝利木單抗的三期臨床研究，兩家企業(yè)平均分擔后期研發(fā)費用，平分商業(yè)利潤。

　　2011年3月9日，F(xiàn)DA正式批準貝利木單抗用于治療SLE，商品名為Benlysta。2012年8月，葛蘭素史克完成對HGS的收購，Benlysta成為葛蘭素史克旗下產(chǎn)品。

　　值得一提的是，貝利木單抗的臨床策略起到了至關(guān)重要的作用，因為貝利木單抗只有輕微的療效。而SLE作為一種復雜的自身免疫疾病，臨床上通常采用多藥聯(lián)合治療，如激素等，這會干擾SLE新藥的療效評估，也成為SLE新藥的最大瓶頸。貝利木單抗在二期臨床中同樣未表現(xiàn)顯著的療效，HGS在分析數(shù)據(jù)時沒有用常規(guī)的臨床癥狀重點，而是組合式的臨床終點。這時候，HGS和葛蘭素史克已經(jīng)意識到激素藥物會嚴重干擾貝利木單抗的療效評估，在隨后的三期臨床中，兩家公司嚴格限制只有服用低劑量潑尼松的患者入組，最大程度避免其他藥物的干擾。調(diào)整策略后，貝利木單抗的三期臨床獲得正面評價，雖然只有輕微療效，仍然成功獲得FDA批準。

　　2016年，Benlysta銷售額為3.06億歐元。