基因工程技術(shù)處理的T細(xì)胞將腫瘤抗體特異性識(shí)別和共刺激信號(hào)結(jié)合，具有非MHC依賴(lài)性的腫瘤抗原特異性識(shí)別、增殖和殺傷能力。近年來(lái)，MM抗原特異性的嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（chimericantigenreceptor，CAR-T細(xì)胞）研究也陸續(xù)開(kāi)展并獲得初步成效。CAR-T細(xì)胞治療成為有效治療多發(fā)性骨髓瘤的新方案。

　　多發(fā)性骨髓瘤（MM）是骨髓惡性漿細(xì)胞克隆增殖性疾病，導(dǎo)致骨髓造血受抑和溶骨性疾病。盡管應(yīng)用傳統(tǒng)化療和造血干細(xì)胞移植以及靶向性藥物治療骨髓瘤，MM仍然不能完全治愈。其中一個(gè)重要原因就是隨著疾病進(jìn)展而出現(xiàn)的免疫缺陷和免疫耐受。天然免疫系統(tǒng)中，MM患者NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)功能都受到削弱，腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞被激活并分泌炎性因子如TNF-α、IL-6等促進(jìn)MM細(xì)胞生長(zhǎng)。MM患者中的抗原提呈細(xì)胞樹(shù)突細(xì)胞吞噬細(xì)菌和抗原提呈能力下降，不能被腫瘤抗原有效刺激并上調(diào)T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)分子。獲得性免疫系統(tǒng)中，MM患者的T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能都被削弱，MM細(xì)胞和MM來(lái)源的骨髓基質(zhì)細(xì)胞促使Treg/Th17平衡向Th17漂移，而Th17細(xì)胞具有免疫抑制功能并能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。T細(xì)胞治療能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，分泌大量促炎細(xì)胞因子從而改善MM患者的免疫功能。

　　CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能

　　嵌合抗原受體由胞外抗原結(jié)合區(qū)[由來(lái)源于單克隆抗體的輕鏈（VL）和重鏈（VH）組成，中間由帶韌性的絞鏈區(qū)連接形成單鏈抗體（scFv）]、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)構(gòu)成。CAR-T細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)決定了CAR-T細(xì)胞可以識(shí)別除了多肽段的廣泛腫瘤抗原，包括神經(jīng)節(jié)苷脂、有機(jī)糖類(lèi)抗原等，并且識(shí)別腫瘤抗原的過(guò)程不受MHC分子的限制，胞內(nèi)區(qū)域提供T細(xì)胞活化所需的共刺激分子，從而促進(jìn)T細(xì)胞增殖，分泌促炎細(xì)胞因子，抗細(xì)胞凋亡等。

　　CAR-T細(xì)胞在MM治療中的應(yīng)用

　　1．CD19

　　MM的異常漿細(xì)胞幾乎不表達(dá)CD19，但是仍有一群低分化的CD19陽(yáng)性細(xì)胞與耐藥和疾病進(jìn)展有關(guān)。基于這群與MM密切相關(guān)的CD19亞群，針對(duì)CD19的CART細(xì)胞（CTL019）治療難治復(fù)發(fā)性MM已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT02135406，美國(guó)賓夕法尼亞）。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)來(lái)源于復(fù)發(fā)MM患者的骨髓漿細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)少量的CD19陽(yáng)性細(xì)胞群，同時(shí)表達(dá)κ輕鏈和B細(xì)胞成熟抗原（B-cellmaturationantigen，BCMA），表現(xiàn)出惡性漿細(xì)胞的特性。患者在接受馬法蘭和自體造血干細(xì)胞移植（ASCT）后給予CTL019細(xì)胞治療，體內(nèi)單克隆免疫球蛋白（M蛋白）濃度和免疫球蛋白重鏈基因表達(dá)水平下降、IL-6下調(diào)伴隨IFN-γ上調(diào)。10例接受臨床試驗(yàn)的患者中有6例保持完全緩解，CTL019的不良反應(yīng)主要為1級(jí)細(xì)胞因子釋放綜合征和ASCT引發(fā)的小腸結(jié)腸炎。由于患者接受了ASCT，CAR-T細(xì)胞治療后的成效不排除ASCT的作用。

　　2．細(xì)胞膜表面糖蛋白（CS1）

　　CS1又被稱(chēng)作信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子（signalinglymphocyticactivationmolecule7，SLAM7），MM細(xì)胞高表達(dá)CS1，而正常免疫細(xì)胞包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞的某些亞群和正常B細(xì)胞都低表達(dá)CS1，骨髓細(xì)胞幾乎不表達(dá)CS1。CS1誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)通路，并且促進(jìn)CD138+MM細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附，發(fā)揮促腫瘤作用。在對(duì)傳統(tǒng)化療敏感或者耐藥的患者中，以CS1為靶點(diǎn)的單克隆抗體和DC疫苗能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，并抑制MM細(xì)胞對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附。在此基礎(chǔ)上，以單克隆抗體為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的CAR-T細(xì)胞治療也具有可行性，且可避免單克隆抗體引起的免疫復(fù)合物沉積。有研究者將anti-CS1-scFv-CD28-CD3ζ片段插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，然后再轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)T細(xì)胞形成CS1-CAR-T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些CAR-T細(xì)胞對(duì)高表達(dá)CS1的MM細(xì)胞系有很強(qiáng)的殺傷作用，細(xì)胞活化標(biāo)志CD69表達(dá)增高，脫顆粒作用增強(qiáng)，高表達(dá)IL-2和IFN-γ。同時(shí)將其應(yīng)用于MM.1S免疫缺陷小鼠模型中，結(jié)果顯示CS1-CAR-T細(xì)胞治療后可發(fā)揮抗腫瘤作用，延長(zhǎng)模型小鼠的生存期。

　　3．BCMA

　　BCMA表達(dá)于MM細(xì)胞，而漿細(xì)胞和成熟B細(xì)胞低表達(dá)或者不表達(dá)BCMA。BCMA屬于TNF受體超家族，結(jié)合B細(xì)胞活化因子（B-cellactivatingfactor，BAFF）以及增殖誘導(dǎo)配體（proliferation-inducingligand，APRIL），進(jìn)而促進(jìn)MM細(xì)胞生長(zhǎng)和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附，BCMA抗體對(duì)MM細(xì)胞系和原代MM細(xì)胞都具有殺傷作用。BCMA缺陷小鼠的B細(xì)胞數(shù)量正常，但B細(xì)胞功能受到抑制。上述研究結(jié)果提示BCMA適合作為MM治療的靶點(diǎn)，并不會(huì)引起正常B細(xì)胞的功能受到明顯影響。融合C12A3.2或者C11D5.3的BCMA-CAR-T細(xì)胞，分別以BCMA-1和BCMA-2為靶點(diǎn)，與BCMA陽(yáng)性的MM細(xì)胞共培養(yǎng)后表現(xiàn)出明顯的反應(yīng)性增殖和殺傷活性，并且高表達(dá)IFN-γ。BCMACAR-T細(xì)胞能識(shí)別并殺傷MM患者來(lái)源的MM細(xì)胞，在MM模型小鼠體內(nèi)通過(guò)穿孔素途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。

　　4．免疫球蛋白輕鏈

　　B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）和慢性B淋巴細(xì)胞白血?。˙-CLL）中，惡性細(xì)胞分泌κ鏈或者λ鏈，體內(nèi)包含κ鏈或者λ鏈的抗體在功能上無(wú)明顯差異，對(duì)κ鏈缺陷小鼠研究表明κ鏈缺陷并不導(dǎo)致對(duì)病原體體液免疫的明顯下調(diào)和易感性的上調(diào)。在MM患者中，只表達(dá)κ輕鏈型者的MM細(xì)胞表面單克隆κ輕鏈抗原的陽(yáng)性檢出率為70%，λ游離輕鏈型者的MM細(xì)胞表面未檢測(cè)到單克隆κ輕鏈抗原。Hutchinson等發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞亞群中CD19+CD27++CD38++細(xì)胞表達(dá)κ輕鏈抗原而其他B細(xì)胞亞群不表達(dá)該抗原。上述研究結(jié)果提示κ輕鏈抗原可以作為MM免疫治療的靶點(diǎn)，并不會(huì)引起免疫功能紊亂。

　　κ輕鏈抗原的單克隆抗體MDX-1097通過(guò)ADCC作用殺傷MM細(xì)胞，來(lái)那度胺通過(guò)上調(diào)MM細(xì)胞表面κ輕鏈抗原的表達(dá)增強(qiáng)MDX-1097的作用。當(dāng)可溶性κ輕鏈抗原達(dá)到較高濃度（>250μg/ml）時(shí)，MDX-1097仍可選擇性結(jié)合靶細(xì)胞，說(shuō)明MDX-1097優(yōu)先結(jié)合靶細(xì)胞。Ⅱ期臨床試驗(yàn)中MDX-1097單藥治療可以誘導(dǎo)部分緩解，血清中κ輕鏈抗原和M蛋白的水平明顯下降，10例MM患者6個(gè)月無(wú)疾病進(jìn)展，部分3級(jí)不良反應(yīng)包括心臟傳導(dǎo)阻滯，肺炎等與MDX-1097無(wú)關(guān)。因此，以該單克隆抗體為基礎(chǔ)的CAR-T細(xì)胞也會(huì)優(yōu)先結(jié)合靶細(xì)胞，不受高濃度游離抗原的影響，與來(lái)那度胺協(xié)同有效殺傷MM細(xì)胞，誘導(dǎo)MM患者緩解。以惡性B細(xì)胞表面κ輕鏈抗原為靶點(diǎn)的46/28ζ+-CAR-T細(xì)胞在體外特異性殺傷κ+腫瘤細(xì)胞系，含有可溶性游離Igκ+的血漿不影響其殺傷效率。46/28ζ+-CAR-T細(xì)胞體外可以殺傷自體和同種異體B-CLL的惡性B細(xì)胞，并分泌大量IL-2，TNF-α和IFN-γ，在小鼠模型體內(nèi)也有持續(xù)的46/28ζ+-CAR-T細(xì)胞增殖和抗腫瘤效應(yīng)。對(duì)難治復(fù)發(fā)性NHL、CLL和MM的κ輕鏈CAR-T細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)已在美國(guó)休斯頓開(kāi)展（NCT00881920）。

　　5．LewisY

　　LewisY抗原是結(jié)合于Ⅱ型血型寡糖鏈的四糖結(jié)構(gòu)，與多種惡性腫瘤的發(fā)生和預(yù)后相關(guān)，包括肺癌、大腸癌等。臨床研究證實(shí)以L(fǎng)ewisY為靶點(diǎn)的單克隆抗體在上皮性腫瘤的治療中安全、有效。Peinert等研究發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞惡變時(shí)會(huì)異常表達(dá)上皮性腫瘤抗原。隨后，Peinert等發(fā)現(xiàn)急性髓系白血?。ˋML）細(xì)胞系KG-1a、K562細(xì)胞以及MM細(xì)胞系RPMI8226-13細(xì)胞高表達(dá)LewisY，該研究中52%的MM患者和46%的AML患者表達(dá)LewisY，而CLL患者LewisY抗原表達(dá)陰性；以L(fǎng)ewisY為靶點(diǎn)的Anti-LeY-scFv-CD28-ζ轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞（LeY-CAR-T細(xì)胞）對(duì)RPMI8226-13細(xì)胞和原代MM細(xì)胞表現(xiàn)出特異性的增殖殺傷活性和反應(yīng)性的IL-2和IFN-γ促分泌作用，且殺傷活性與LeY的表達(dá)水平成正相關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示LeY-CAR-CD8+T細(xì)胞有中央記憶性T細(xì)胞和效應(yīng)記憶性T細(xì)胞亞群的分化，LeY-CAR-CD8+T細(xì)胞能夠在體內(nèi)發(fā)揮長(zhǎng)期的抗MM作用。在高表達(dá)LewisY的小鼠模型中，LeY-CAR-T細(xì)胞治療組生存期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)。在臨床前實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上開(kāi)展了LeY-CAR-T細(xì)胞對(duì)預(yù)后較差的MM和AML患者的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT01716364，澳大利亞墨爾本）。

　　6．食管鱗狀細(xì)胞癌抗原（NY-ESO-1）

　　多種惡性腫瘤高表達(dá)NY-ESO-1，包括黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等，而正常組織不表達(dá)或者低表達(dá)NY-ESO-1。在60例MM患者中，35例（60%）患者在基因和蛋白水平檢測(cè)出NY-ESO-1陽(yáng)性表達(dá)，在細(xì)胞遺傳學(xué)異常和復(fù)發(fā)的MM患者中NY-ESO-1的表達(dá)水平更高，提示NY-ESO-1與MM的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。NY-ESO-1是腫瘤/睪丸抗原（cancer/testisantigens）中最具免疫原性的抗原，能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)抗原抗體反應(yīng)和特異性CTL。NY-ESO-1在多種腫瘤中表達(dá)升高的機(jī)制還有待研究，但是可以肯定的是NY-ESO-1高表達(dá)提示預(yù)后較差。所以，以NY-ESO-1為靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞可以作為MM治療的有力手段。識(shí)別NY-ESO-1157-165肽段和HLA-A*0201的CAR-T細(xì)胞（HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細(xì)胞）中，40%的細(xì)胞為不表達(dá)CCR7的效應(yīng)T細(xì)胞，5%為CCR陽(yáng)性的記憶性T細(xì)胞，后者能在特異性抗原的刺激下重新分化為效應(yīng)細(xì)胞，并分泌IL-2。臨床前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細(xì)胞的靶向治療作用，并誘導(dǎo)免疫記憶，有望進(jìn)行下一步的臨床實(shí)驗(yàn)。對(duì)該CAR-T細(xì)胞的胞外抗體結(jié)合區(qū)（HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165）的抗獨(dú)特型抗體FabA4能夠結(jié)合抗HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細(xì)胞，并以NY-ESO-1陽(yáng)性細(xì)胞相似的方式活化T細(xì)胞，與NY-ESO-1157-165游離肽段相比，刺激CAR-T細(xì)胞增殖的能力更強(qiáng)。HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細(xì)胞對(duì)高表達(dá)NY-ESO-1的腫瘤細(xì)胞具有特異性的殺傷作用，但是某些乳腺癌細(xì)胞和MM細(xì)胞低表達(dá)NY-ESO-1，限制了該CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用。NY-ESO-1的表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)域的去甲基化有關(guān)，而5-aza-2′-deoxycytidine（DAC）這種去甲基化的藥物能夠顯著提高U266細(xì)胞中NY-ESO-1基因和蛋白水平的表達(dá)，并促進(jìn)HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和對(duì)腫瘤的殺傷作用?？躬?dú)特型抗體FabA4和去甲基化藥物DAC都能進(jìn)一步提高HLA-A*0201/NY-ESO-1157-165CAR-T細(xì)胞的效率。

　　7．CD138、CD38和CD56

　　CD138、CD38和CD56通常共同表達(dá)在MM細(xì)胞表面，在一項(xiàng)對(duì)306例MM患者的臨床研究中，結(jié)果顯示CD138、CD38和CD56的陽(yáng)性檢出率分別為100%、100%和78.7%，CD138作為MM的基本診斷指標(biāo)，與腫瘤生長(zhǎng)和MM疾病進(jìn)展密切相關(guān)。CD138-CAR-T細(xì)胞聯(lián)合泊馬度胺體外殺傷RPMI8226和U266細(xì)胞，并誘導(dǎo)IFN-γ分泌。解放軍總醫(yī)院開(kāi)展了CD138的CAR-T細(xì)胞靶向治療的臨床實(shí)驗(yàn)（NCT01886976），但目前尚無(wú)完整的數(shù)據(jù)。細(xì)胞表面的CD38活化后促進(jìn)細(xì)胞底物的磷酸化激活NF-κB信號(hào)通路，而NF-κB信號(hào)通路與MM細(xì)胞的耐藥密切相關(guān)。CD56是MM特異性的指標(biāo)，隨著疾病進(jìn)展CD56的缺失提示MM的髓外浸潤(rùn)和漿細(xì)胞白血病。以CD38為靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞（CD38-CAR-T細(xì)胞）在體外特異性殺傷MM細(xì)胞系細(xì)胞和原代MM細(xì)胞，CD56-CAR-T細(xì)胞（5×106）可有效清除MM模型小鼠的腫瘤[33，34]。但是CD138、CD38和CD56也表達(dá)于某些正常細(xì)胞上，如CD138表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞，CD38表達(dá)于造血干細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等，CD56表達(dá)于中樞神經(jīng)元和NK細(xì)胞。如何避免CD138、CD38和CD56的CAR-T細(xì)胞對(duì)正常組織細(xì)胞的不良反應(yīng)是下一步研究的方向。

　　8．NK細(xì)胞活化受體NKG2D

　　NKG2D受體是NK細(xì)胞和T細(xì)胞的活化受體，其配體為MICA、MICB、ULBP1-3和Letal（ULBP4），表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，包括淋巴瘤、白血病和MM。原代MM細(xì)胞和多種MM細(xì)胞系細(xì)胞均可表達(dá)NKG2D的配體，包括MICA和ULBPs。正常組織細(xì)胞不表達(dá)NKG2D的配體，當(dāng)發(fā)生DNA損傷，感染或者惡變時(shí)才合成該配體。以患者和健康人的T細(xì)胞合成NKG2D-CART細(xì)胞，兩者均以穿孔素的方式殺傷MM細(xì)胞，并且分泌IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和趨化因子CCL5，NKG2D-CAR-T細(xì)胞對(duì)MM患者的骨髓樣本中少量的MM細(xì)胞都具有反應(yīng)性IFN-γ分泌，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NKG2D-CAR-T細(xì)胞，結(jié)果顯示主要是表達(dá)CD27、CCR7、CD26L和高表達(dá)CD45RO的效應(yīng)T細(xì)胞。游離的MICA分子通過(guò)下調(diào)NK細(xì)胞和T細(xì)胞NKG2D的表達(dá)抑制兩種細(xì)胞對(duì)腫瘤的反應(yīng)性，但該小組研究表明NKG2D-CAR-T細(xì)胞在較高的MICA濃度（>1.5×106pg/ml）時(shí)才會(huì)受到抑制。在小鼠5T33MM模型中，NKG2D-CAR-T細(xì)胞組生存期顯著優(yōu)于對(duì)照組，在注射N(xiāo)KG2D-CAR-T細(xì)胞1d后，骨髓和脾臟中都檢測(cè)到CAR-T細(xì)胞，并且小鼠血清中IFN-γ也隨之升高。小鼠體內(nèi)CD4+和CD8+T細(xì)胞細(xì)胞活化標(biāo)志CD69表達(dá)上調(diào)，對(duì)再次注射5T33MM細(xì)胞表現(xiàn)出免疫反應(yīng)，說(shuō)明NKG2D-CAR-T細(xì)胞能在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化和免疫記憶T細(xì)胞。有研究表明NKG2D-CAR-T細(xì)胞可以下調(diào)體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量，并且誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞成為促進(jìn)免疫的細(xì)胞亞型。蛋白酶體抑制劑硼替佐米、馬法蘭、多柔比星通過(guò)影響DNA損傷途徑上調(diào)原代MM細(xì)胞NKG2D配體的表達(dá)，而沙利度胺和地塞米松沒(méi)有這種效應(yīng)，基于這個(gè)機(jī)制聯(lián)用這些藥物可能增強(qiáng)NKG2D-CAR-T細(xì)胞對(duì)MM細(xì)胞的識(shí)別從而提高殺傷效率。

　　9．CD44的異構(gòu)體6（CD44v6）

　　CD44在造血系統(tǒng)腫瘤和上皮性腫瘤中選擇性高表達(dá)，被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記之一。轉(zhuǎn)導(dǎo)了BCR-ABL基因的CD44-/-的造血干細(xì)胞不能誘導(dǎo)小鼠白血病的發(fā)生，CD44特異性單克隆抗體成功消除小鼠體內(nèi)的AML干細(xì)胞，防止AML的發(fā)病。意義未明單克隆免疫球蛋白血癥和MM患者來(lái)源的CD138+漿細(xì)胞均表達(dá)CD44v6，并且隨著疾病進(jìn)展表達(dá)陽(yáng)性率也升高，CD44v6與13q14染色體缺失具有相關(guān)性，CD44v6在胰腺、乳腺、頭頸部組織惡變中也起到關(guān)鍵作用。造血干細(xì)胞不表達(dá)CD44v6，在活化的T細(xì)胞、單核細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞也均呈低表達(dá)，使得CD44v6成為合適的CAR-T細(xì)胞靶點(diǎn)。CD44v6.CAR28z+T細(xì)胞體外殺傷表達(dá)CD44v6的MM細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示CD44v6.CAR28z+T細(xì)胞中分化出表達(dá)IL-7Rα和CXCR4的記憶性T細(xì)胞亞群。來(lái)源于患者具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)活性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不影響CD44v6.CAR28z+T細(xì)胞的殺傷活性，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明CD44v6.CAR28z+T細(xì)胞不會(huì)攻擊正常角質(zhì)細(xì)胞，不良反應(yīng)僅限于可逆性的單核細(xì)胞減少。