BMS和Merck藥廠PD-1抗體藥物的上市，將腫瘤免疫，尤其是免疫檢查點抗體藥物的研發(fā)帶進了一個新紀元。腫瘤免疫治療是國內(nèi)外眾多藥企積極投入的一個熱門領域。預計將來70％以上的腫瘤可以通過抗體藥物得到治愈。與此同時，中國醫(yī)藥企業(yè)有可能在腫瘤免疫抗體藥物研發(fā)領域?qū)崿F(xiàn)彎道超車。

　　與小分子藥物不同，抗體藥物研發(fā)由于靶點明確，研發(fā)過程更有方向性和可控性。聯(lián)合用藥以及雙特異性抗體研發(fā)在今后5年會非常熱鬧且競爭激烈。由于免疫檢查點抗體藥物是通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)進行腫瘤治療，所以，動物體內(nèi)實驗是驗證和評價這類藥效的最佳途徑，尤其是聯(lián)合用藥及雙特異性抗體藥物藥效評價。

　　在選擇體內(nèi)藥效評價模型方面，小鼠無疑是最常用的動物模型。首先，小鼠的繁殖快，可以快速得到有統(tǒng)計學意義的同周齡、同性別、且足量的小鼠；第二，有足夠多的近交系小鼠腫瘤細胞系可以使用；第三，容易建立較穩(wěn)定的動物－腫瘤模型體系，建立標準化的藥效評價平臺。

　　然而，通過比較可以發(fā)現(xiàn)，普通小鼠的免疫檢查點基因與對應的人類基因之間，在蛋白氨基酸序列上同源性一般在60%左右。所以，一般情況下識別人蛋白的抗體，并不識別小鼠相應基因蛋白。也就是說，我們一般不能用普通小鼠來評價抗人蛋白抗體的藥效。這就需要對小鼠的免疫檢查點基因進行人源化改造。比如，將小鼠的PD1基因胞外部分換成人的對應部?？梢钥吹剑嗽椿蟮男∈罂梢杂脕碜鯽nti-humanPD1抗體的藥效評價。

　　1）小鼠品系：這個是首先要考慮的。這個可以根據(jù)我們將來用什么腫瘤細胞系做研究，來決定采用什么品系的小鼠來做基因人源化。比如我們要用MC38、B16F10、LLC1等C57BL/6遺傳背景的腫瘤細胞系，就一定要在C57BL/6遺傳背景的小鼠上做基因改造。（這個大家可以理解，這與配型不對的人之間不能做器官移植是一個道理）。

　　這個稍微提一下的是，如果用胚胎干細胞(ESC)來打靶的話，一定要用純系C57BL/6遺傳背景的ESC來打靶。如果用129或129/B6背景的ESC做打靶，就需要用C57BL/6小鼠來回交10代以上，否則實驗結(jié)果會很不穩(wěn)定。腫瘤細胞在這種小鼠上接種之后，即使不做抗體處理，腫瘤生長曲線也會是鐘型，也就是說到后期會縮下來。而且個體之間腫瘤生長曲線差異很大。而用純系的C57BL/6做的人源化小鼠，腫瘤會越長越快，直到小鼠不能承受。而且不同個體之間腫瘤生長曲線較一致。

　　2）設計考慮：在設計的時候，需要考慮信號傳遞（signaltransduction)。對于免疫細胞，信號傳遞包括蛋白受體胞外部分與配體結(jié)合、通過穿膜區(qū)與其它蛋白聚合形成復合物、以及通過胞內(nèi)區(qū)的特定domain(ITAM，ITAM等)跟下游蛋白進行結(jié)合并輸送信號等。為了不影響目標蛋白的信號傳遞，我們的default設計一般是只替換胞外部分，而保留小鼠基因的穿膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。

　　我們的default打靶方案一般是在基因組上直接替換，而不建議將人基因的cDNA（或人鼠嵌合cDNA)插入到小鼠的起始密碼子ATG的位置。因為我們發(fā)現(xiàn)這種方式有很大概率蛋白表達水平太低或沒有表達，同樣造成實驗結(jié)果的不穩(wěn)定。

　　3）雙敲進小鼠：聯(lián)合用藥以及雙特異性抗體藥效評價會非常依賴于雙基因敲進小鼠。如果兩個基因不在同一條染色體上，我們一般先分別進行打靶，然后再將單基因敲進人源化小鼠進行交配，得到雙人源化小鼠。在這個過程中，一定要驗證每一個單基因人源化小鼠是正確而有功能的。制備雙基因人源化小鼠，在小鼠品系的選擇上將更加關(guān)鍵。如果采用CRISPR方法在C57BL/6上做打靶，一般不會有什么問題。但是，如果利用ESC來做打靶，需要特別注意的是ESC的遺傳背景一定是C57BL/6。否則漫長的回交過程需要幾年時間。如果任何一個單人源化小鼠的回交代次不夠，就會使得雙人源化小鼠的遺傳背景更加混亂，實驗結(jié)果更加不穩(wěn)定。