上個(gè)月，2018諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了美國(guó)的JamesAllison和日本的TasukuHonjo教授，以表彰兩位及其團(tuán)隊(duì)在腫瘤免疫治療上的巨大貢獻(xiàn)。

以PD-1單克隆抗體為代表的免疫療法，自2014年誕生以來，讓全世界都見識(shí)到了其在腫瘤治療方面的巨大潛力。一時(shí)間，國(guó)內(nèi)外藥企加入了這條研發(fā)賽道，各家PD-1或初戰(zhàn)告捷或蓄勢(shì)待發(fā)。已登陸的O藥和K藥不消多說，就是處于在研階段的新藥也如恒河沙數(shù)。

面對(duì)這些如雨后春筍般涌現(xiàn)的同類藥物，除了臨床試驗(yàn)以外，就沒有其他評(píng)價(jià)方式來幫助我們?cè)u(píng)價(jià)它們的好壞嗎？

當(dāng)然不是。要知道從雜交瘤技術(shù)出現(xiàn)至今，治療性單克隆抗體的制備技術(shù)已經(jīng)數(shù)次迭代，單抗“生來如何”基本決定了能走多遠(yuǎn)，我們也擁有了一套通用的臨床前評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，可以借此對(duì)藥物在臨床上的表現(xiàn)作出預(yù)估。

今天咱們就以幾個(gè)國(guó)內(nèi)外的PD-1抑制劑為例，來嘮嘮單抗的制備技術(shù)和臨床前特征。想講清楚這其中的故事，還得從單抗的結(jié)構(gòu)說起，畢竟結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)嘛。

絕大多數(shù)治療性抗體都是IgG。IgG由四條肽鏈組成，兩重兩輕，每條鏈又可分為恒定區(qū)（CH/CL）與可變區(qū)（VH/VL），這就是抗體最基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)了。

在這個(gè)基礎(chǔ)上，每個(gè)可變區(qū)內(nèi)又存在三個(gè)短多肽鏈形成的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），與可變區(qū)的其他部分相比，CDR序列可變性更高?？梢哉f可變區(qū)決定了抗體的抗原結(jié)合能力，而CDR又是核心中的核心。

抗體的結(jié)構(gòu)還有另一種分法，就是可結(jié)晶片段（Fc）+抗原結(jié)合片段（Fab），這個(gè)也有用處，我們后面說

說起來抗體的結(jié)構(gòu)還真是挺復(fù)雜的，不是人力可以完美仿造的。要知道，抗體的多個(gè)結(jié)構(gòu)域都是相對(duì)獨(dú)立、模塊化的，每個(gè)部分的組成都在基因組中有復(fù)數(shù)的備份，特別是CDR，CDR自己可以分為V、D、J三種片段，它們的組合給了CDR超級(jí)豐富的變化，我們把這叫做VDJ重組。

這還不是最大的“殺器”。當(dāng)被抗原激活，生產(chǎn)抗體的B細(xì)胞開始迅速增殖，它們編碼可變區(qū)的基因?qū)?huì)以遠(yuǎn)超其他細(xì)胞的速度開始突變，這種名為體細(xì)胞超突變（SHM）的過程使得B細(xì)胞每一次分裂產(chǎn)生的后代都微妙地有所不同。隨后，輔助T細(xì)胞則會(huì)對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步選擇，只有那些產(chǎn)生高親和力抗體的B細(xì)胞才能獲得資源存活下來，這個(gè)過程叫親和力成熟。

免疫系統(tǒng)的大智慧還有更多，咱們今天了解這些就夠了。所以說，機(jī)體內(nèi)能夠以一套極其高效率的程式快速瞄準(zhǔn)抗原生產(chǎn)具有足夠治療效率的抗體，這是體外“手工”優(yōu)化比不了的。

不過也好在抗體這種樂高一樣的模塊化結(jié)構(gòu)，這給了我們借助科技改造它的機(jī)會(huì)。

人類對(duì)抗體的了解實(shí)在是走得太慢了。十九世紀(jì)末，才有科學(xué)家模模糊糊摸到了體液免疫的衣擺，又過了一百年，第一個(gè)單抗藥物才正式面世。不過后面的故事我們也知道，這款藥物之后，F(xiàn)DA9年沒敢再碰單抗，沒有別的原因，就是副作用太大了，病人消受不起。

最早的蛇毒血清其實(shí)是馬的血清，幸運(yùn)的是你很難被同一種毒蛇咬兩次，單抗藥物就不一樣了，一般來說只要用了就得是持續(xù)使用。

第一個(gè)單抗藥得益于當(dāng)時(shí)出現(xiàn)不久的雜交瘤技術(shù)，單純來說它就是一種小鼠產(chǎn)生的、小鼠自己的抗體，首先它不一定完美契合人類抗原，其次給人輸進(jìn)去，人體也會(huì)產(chǎn)生針對(duì)它的抗藥抗體（ADA），好一點(diǎn)就是越用越?jīng)]用，壞一點(diǎn)再引發(fā)個(gè)超敏反應(yīng)，病人性命堪憂。

從此科學(xué)家開始了從鼠到人的探索。

這里抗體的模塊化結(jié)構(gòu)就派上用場(chǎng)了。起先科學(xué)家是把小鼠抗體的可變區(qū)揪下來，和人類抗體的恒定區(qū)連在一起，這樣生成的單抗實(shí)際上60%到70%都是人類的了，免疫原性已經(jīng)大大降低了，這就是嵌合抗體的誕生。

現(xiàn)代的抗體制備技術(shù)已經(jīng)又前進(jìn)了兩步了，一是替換程度已經(jīng)精細(xì)到CDR的人源化抗體，一是全人源抗體。人源化抗體已經(jīng)有90%以上都是人類的了，全人源則故名思義，百分百人類，理論上幾乎不會(huì)引發(fā)不必要的免疫反應(yīng)。

這里還可以教大家一個(gè)從名識(shí)類別的小訣竅。單抗們的通用名都巨老長(zhǎng)，一眼看過去令人頭昏眼花，咱們可以把它們拆一拆。首先最末尾的mab大家肯定都曉得了，就是單抗的意思，再往前看兩個(gè)字母，這里邊就藏著大秘密。根據(jù)單抗命名法則，這倆字母如果是xi，那它就是個(gè)嵌合抗體；如果是zu，說明是一種人源化抗體；如果只有一個(gè)u，那恭喜你了，這是一款全人源抗體。

舉個(gè)例子，剛來中國(guó)不久的O藥和K藥，前者通用名nivolumab，可見是個(gè)全人源單抗，后者pembrolizumab，咱們就知道它是個(gè)人源化抗體了。

從人源化到全人源，雖說只是不到10%的差異但卻難比登天，畢竟我們不能直接免疫人體獲得抗體。

在這里科學(xué)家們選擇了兩條截然不同的道路——噬菌體展示和轉(zhuǎn)基因小鼠。前者利用了噬菌體/原核生物傳代快的優(yōu)勢(shì)，通過體外抗原抗體結(jié)合能力來篩選目標(biāo)大分子；后者則是將人源抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，間接實(shí)現(xiàn)了“免疫人”。

這兩項(xiàng)技術(shù)終于把單抗的制備技術(shù)帶到了華山之巔，整個(gè)生物制劑領(lǐng)域有了一次飛躍，特別是后者，最早一批實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的Medarex為首個(gè)CTLA-4抑制劑和PD-1抑制劑鋪平了道路。

這兩種技術(shù)出發(fā)點(diǎn)都是實(shí)現(xiàn)全人源，不過各自的優(yōu)缺點(diǎn)也是很明顯。噬菌體展示技術(shù)基于大腸桿菌和噬菌體，生產(chǎn)速度是很快的——問題也出在這里，咱們知道蛋白不是光氨基酸序列對(duì)了就行，三維結(jié)構(gòu)也很重要，而噬菌體對(duì)蛋白三維折疊的加工顯然是不如真核細(xì)胞精細(xì)的，就算后來又發(fā)展出了酵母展示技術(shù)，也是沒法和哺乳動(dòng)物細(xì)胞比較。

另外，還記得咱們前面說過的B細(xì)胞的幾個(gè)大殺器嗎，這套全自動(dòng)優(yōu)化流程噬菌體展示技術(shù)是代替不了的，想要得到高親和力的抗體，還需要進(jìn)行更加漫長(zhǎng)的篩選和人工改造。

轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的特點(diǎn)就與此完全相反了。相對(duì)來說，給小鼠建立免疫的過程會(huì)較長(zhǎng)，但是抗體生成的大部分過程都是在體內(nèi)進(jìn)行的，只要抗原暴露充分，就能夠得到親和性足夠高的抗體，就不需要繁瑣的“手動(dòng)”優(yōu)化了，而且這些抗體從理論上來說跟人體產(chǎn)生的不會(huì)有很大差別。

所以我們?cè)趺粗酪粋€(gè)單抗好不好？

其實(shí)在一個(gè)單抗應(yīng)用在患者身上之前，我們已經(jīng)能從其體外特征上大致看出它是否具有大展宏圖的潛力了。

以PD-1抑制劑為例，首先要具有能與PD-1高親和高特異性結(jié)合的可變區(qū)；其次功能上為了避免對(duì)靶細(xì)胞、也就是T細(xì)胞的毒性，應(yīng)選用IgG4亞型；再次，IgG4抗體在體內(nèi)會(huì)發(fā)生重鏈重組，S228P修飾能夠避免這個(gè)問題讓抗體結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定；最后，單抗的制備方法、也就是單抗來源，一定程度上能夠說明它可能具有的免疫原性。（點(diǎn)這里復(fù)習(xí)誕生記）

在結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，單抗在臨床前實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的親和力、特異性、免疫原性、Fc段特征和功能性，這些就是我們?cè)u(píng)估單抗綜合實(shí)力的數(shù)據(jù)指標(biāo)了。

抗體依賴與抗原的特異性結(jié)合發(fā)揮作用，最理想的情況肯定是每個(gè)抗體都能夠百分百結(jié)合抗原，發(fā)揮最大效能。以一當(dāng)百喜聞樂見，以百當(dāng)一就有點(diǎn)說不過去了對(duì)不對(duì)。單抗的親和力到底有多強(qiáng)，直接影響到了藥物效果、臨床的最佳劑量和部分副作用程度。

單抗的親和力看的主要是兩個(gè)指標(biāo)，EC50和IC50。

EC50指的是半數(shù)效應(yīng)濃度，指的是藥物在引起50%最大效應(yīng)變化時(shí)的濃度；IC50指的是半數(shù)抑制濃度，指的是某種抑制劑實(shí)現(xiàn)最大抑制效果50%時(shí)的濃度。在PD-1抑制劑這里呢，EC50和IC50關(guān)系到藥物與PD-1的結(jié)合能力和抑制PD-1與PD-L1/2結(jié)合能力。

說得更通俗一些，這倆數(shù)值越小、抗體的親和力越高，那么臨床達(dá)標(biāo)的最佳劑量就可能更低，副作用可能更小。

單抗藥物最大的優(yōu)點(diǎn)，就是當(dāng)年P(guān)aulEhrlich提到的“魔法子彈”，只針對(duì)標(biāo)靶絕不誤傷正常組織，一個(gè)讓打誰就只打誰的單抗才是好單抗。這一點(diǎn)可以通過免疫組化分析，來確定抗體是否對(duì)正常組織“出手”。

在今天涉及的四種藥物中，只有nivolumab對(duì)于其特異性作了詳細(xì)披露。原則上nivolumab特異性結(jié)合PD-1，不與其他免疫球蛋白超家族成員，例如CD28、CTLA-4等發(fā)生作用，研究者們通過免疫組化在多個(gè)人類組織中證實(shí)了這一點(diǎn)。從結(jié)果來看，包括心、肝、肺、腎、脾、小腦等在內(nèi)的多個(gè)組織都未出現(xiàn)特異性染色，只有垂體在20倍抗體濃度下表現(xiàn)出了低免疫活性，不過該組織并未檢出PD-1表達(dá)。

從某個(gè)角度來說，單抗本身也可以被免疫系統(tǒng)當(dāng)作是一種抗原，具有免疫原性，免疫系統(tǒng)有可能會(huì)產(chǎn)生抗藥物抗體（ADA）。

這顯然不是我們?cè)敢饪吹降?，一是ADA會(huì)加速單抗藥物的清除，這意味著第一次使用有效的藥量很可能第二次就不夠用了，必須不斷增加使用量或頻次，直到最后完全沒用；二是如果免疫原性過強(qiáng)，很容易激起機(jī)體的過度免疫反應(yīng)，帶來一系列副作用——可比打不過感冒病毒發(fā)燒流鼻涕嚴(yán)重多了。

ADA也和我們體內(nèi)的其他抗體一樣分為好幾類，其中對(duì)藥效影響最大的就是中和抗體。

從臨床數(shù)據(jù)來看，CA209066研究中107位患者中僅有6位（5.6%）患者出現(xiàn)ADA，其中未檢測(cè)出中和抗體；綜合6項(xiàng)臨床研究的數(shù)據(jù)，也僅有0.3%的患者持續(xù)表現(xiàn)出ADA陽性。而且無論ADA還是中和抗體，它們的存在都與超敏反應(yīng)、輸注反應(yīng)或藥物失效無關(guān)，可以認(rèn)為nivolumab在臨床上是沒有免疫原性的。

另一方面，pembrolizumab臨床試驗(yàn)中1289名患者有26名（2.01%）出現(xiàn)ADA，這26位患者中有4位進(jìn)行了中和抗體檢測(cè)，顯示1位中和抗體陽性。

不過免疫原性在臨床上受到藥物本身、儲(chǔ)存方法、患者條件、檢測(cè)方法等多因素影響，這方面很難直接對(duì)比。

對(duì)PD-1抑制劑來說，對(duì)Fc段的要求有些特別。大部分治療性單抗的目的都是結(jié)合抗原抓住致病原，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞殺敵，前者通過CDR的特異性識(shí)別實(shí)現(xiàn)，后者則是通過Fc段結(jié)合免疫細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。但是PD-1抑制劑不同的點(diǎn)在于，它結(jié)合的標(biāo)靶PD-1是位于T細(xì)胞上的，但PD-1抑制劑可不是來消滅T細(xì)胞的。

于是，為了避免同類相殘的慘劇，PD-1抑制劑的制備選用的大都是IgG4型抗體。這個(gè)亞型很溫柔，其天然的抗體依賴的細(xì)胞毒性（ADCC）很弱，補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性（CDC）也幾乎沒有，如果再加以一些修飾能夠去除這兩大項(xiàng)作用就更加完美了。是否有ADCC和CDC存在，也是衡量PD-1單抗效果的指標(biāo)之一。

Fc段特征在評(píng)價(jià)PD-1單抗方面還是很重要的，會(huì)直接影響到T細(xì)胞的工作效率or存亡與否。

PD-1抑制劑的最終目的是解放T細(xì)胞的潛能、讓它去殺癌細(xì)胞。在這一點(diǎn)上，一方面IFN、IL等細(xì)胞因子的釋放已經(jīng)被證實(shí)與T細(xì)胞激活有關(guān)，另一方面，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況也是很好的選擇。我們不妨對(duì)已披露數(shù)據(jù)一探究竟。

對(duì)健康供者細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在有抗原刺激的條件下，低濃度的nivolumab就能夠顯著增加T細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)IFN-γ和IL-2的釋放，同時(shí)并不會(huì)導(dǎo)致非特異性淋巴細(xì)胞的激活。

JS-001的功能實(shí)驗(yàn)顯示其能有效刺激T細(xì)胞增殖和IFN-γ、TNF-α釋放，同時(shí)還與nivolumab進(jìn)行了橫向比較?？梢奐S-001功能性與劑量相關(guān)性更大，較高劑量時(shí)細(xì)胞因子水平更高；而nivolumab的發(fā)揮更“穩(wěn)定”，極低劑量也能達(dá)到一定效果。

功能性實(shí)驗(yàn)可以說是對(duì)前述體外特征的進(jìn)一步驗(yàn)證。

總的來說，單抗藥物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是決定其功能效應(yīng)的先決條件。面對(duì)一款PD-1單抗，我們只有把牢其最基本的評(píng)價(jià)原則——從親和性、特異性、免疫原性、Fc段特征入手，結(jié)合其在功能性實(shí)驗(yàn)上的表現(xiàn)，才能初步判斷它是否具有一飛沖天的潛力。

這些特征在臨床上也是能被進(jìn)一步證實(shí)的，比如nivolumab的臨床數(shù)據(jù)顯示，nivolumab與PD-1的結(jié)合似乎不依賴于劑量，首次用藥后4-24小時(shí)即出現(xiàn)平均峰值85%，這與nivolumab在體外表現(xiàn)出的高親和性是一致的。

追本溯源，回歸原點(diǎn)。只有從最開始了解PD-1單抗的臨床前特征，才能幫助我們真正慧眼識(shí)英雄。