ZNF281對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲與遷移的影響

　　方法選取本院2014年6月至2016年6月收治的50例結(jié)直腸癌患者的癌灶標(biāo)本及20例癌旁正常黏膜標(biāo)本，比較不同標(biāo)本中ZNF281的表達(dá)情況，利用Transwell小室觀察ZNF281對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響，并分析ZNF281與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

　　結(jié)果ZNF281在結(jié)直腸癌標(biāo)本中的陽性表達(dá)率為84.00%，在癌旁正常黏膜中陽性表達(dá)率為20.00%，且?guī)缀鯚o強(qiáng)陽性表達(dá)，差異具有顯著性（P＜0.05）。Transwell小室侵襲檢測結(jié)果提示，ZNF281高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于ZNF281低表達(dá)組和ZNF281陰性表達(dá)組（P＜0.05）；Transwell小室遷移檢測結(jié)果提示，ZNF281高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于ZNF281低表達(dá)組和ZNF281陰性表達(dá)組（P＜0.05）。ZNF281表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位無相關(guān)性（P＞0.05），但其在結(jié)直腸癌不同分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Duke's分期方面均具有顯著差異（P＜0.05）。

　　結(jié)論ZNF281在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平升高，且不同病理分化程度組織中ZNF281表達(dá)有顯著差異。ZNF281可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生，同時可影響癌細(xì)胞的遷移能力，檢測ZNF281表達(dá)對結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后具有一定臨床意義。

　　關(guān)鍵詞：鋅指蛋白281；結(jié)直腸癌；侵襲；遷移

　　結(jié)直腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率、高死亡率及低治愈率的特點(diǎn)[1]。近年來雖然結(jié)直腸癌的診斷和治療較既往有了很大進(jìn)步，但患者總體生存率并未得到明顯改善，5年生存率約為55%，尤其對于晚期結(jié)直腸癌，多伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后極差[2]。目前臨床多采用外科治療結(jié)直腸癌，通過根治性切除癌灶，以緩解該病進(jìn)展。研究顯示，僅70%的結(jié)直腸癌患者可行直腸癌根治術(shù)治療，且此類患者的預(yù)后與腫瘤病理學(xué)分期具有相關(guān)性，通常將是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為預(yù)測患者預(yù)后的因素[3，4]?；虬邢蛑委熆赏ㄟ^特定基因靶點(diǎn)抑制腫瘤細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用，是目前治療腫瘤的新策略[5]。鋅指蛋白（zincfingerprotein，ZNF）是指與Zn2+結(jié)合的一類蛋白質(zhì)，其可選擇性結(jié)合于特異的靶結(jié)構(gòu)，在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化及胚胎發(fā)育等過程中具有重要作用[6]。

　　ZNF281是ZNF的亞型，該蛋白在腫瘤惡性增殖或病變細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[7]。本研究分析了ZNF281對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲與遷移的影響，旨在探討ZNF281表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，具體報道如下。

　　1、資料與方法

　　1.1、資料

　　50例結(jié)直腸癌標(biāo)本和20例癌旁正常黏膜標(biāo)本均取自2014年6月至2016年6月于本院行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者，其中，男29例，女21例；年齡27～80歲，平均（56.4±12.5）歲。入組標(biāo)本均行病理切片檢查確診為結(jié)直腸癌，患者術(shù)前均未接受放、化療或其他腫瘤綜合治療。標(biāo)本組成：直腸癌21例，結(jié)腸癌29例，癌旁正常黏膜20例。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

　　1.2、方法

　　1.2.1、標(biāo)本采集及處理

　　經(jīng)手術(shù)獲取癌灶組織和癌旁正常黏膜組織，生理鹽水沖洗3次，置于10%中性甲醛溶液中固定48小時，常規(guī)脫水后石蠟包埋，制成4.0μm厚度的切片，而后對切片行HE染色，進(jìn)行病理學(xué)診斷分析。

　　1.2.2、ZNF281表達(dá)檢測

　?、偃?片石蠟包埋后的切片進(jìn)行ZNF281免疫組織化學(xué)染色，切片于60℃孵箱中加熱1小時，脫蠟、水化，除去內(nèi)源性過氧化物酶，將組織非特異性抗原封閉?？贵w標(biāo)記：一抗選用兔抗人ZNF281單克隆抗體（上海瑞齊生物科技有限公司生產(chǎn)，濃度為99%，具體使用方法參照說明書），4℃孵育1小時；二抗選用經(jīng)生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（北京意宏安生物科技有限公司生產(chǎn)，濃度為0.5mg/ml，具體使用方法參照說明書），37℃孵育30分鐘。②2名病理科主治醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立閱片，ZNF281表達(dá)的評定主要依據(jù)組織染色強(qiáng)度和顯色比例。評分標(biāo)準(zhǔn)：1分：顯色陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比＜11%；2分：顯色陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比為11%～50%；3分：顯色陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比為51%～80%；4分：顯色陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比＞80%。依據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：1分：弱染色；2分：中等染色；3分：強(qiáng)染色。依據(jù)顯色和染色強(qiáng)度將結(jié)果分為3級：無論染色強(qiáng)度如何，其顯色比例評分≤1分為陰性（－），評分為2～3分為弱陽性（＋），評分為4～7分為強(qiáng)陽性［（＋＋）～（＋＋＋）］。

　　1.2.3、Transwell侵襲與遷移實驗

　　結(jié)直腸癌細(xì)胞（HCT116）由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，置于含有10%胎牛血清培養(yǎng)液（江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司）中，于37℃、5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，用0.25%濃度的胰蛋白酶消化常規(guī)傳代（細(xì)胞培養(yǎng)4代后）。將結(jié)直腸癌細(xì)胞傳代接種于無菌6孔板中，濃度為100個/100μl，待細(xì)胞貼壁后，用無血清培養(yǎng)液（江陰劍橋生物技術(shù)有限公司）培養(yǎng)，同時各取250μl無血清的培養(yǎng)液分別稀釋ZNF281過表達(dá)的質(zhì)粒（分為陰性表達(dá)、低表達(dá)及高表達(dá)，由南京德享文生物技術(shù)公司提供），靜置10分鐘后輕柔混勻，再次靜置10分鐘后加入細(xì)胞上清液中，6小時后換為完全培養(yǎng)液（江陰劍橋生物技術(shù)有限公司提供）繼續(xù)培養(yǎng)48小時進(jìn)行后續(xù)實驗。①侵襲實驗：將上述細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)液中，以5×104個/孔的密度加入預(yù)先鋪好Matrigel膠的Transwell小室上室內(nèi)，向下室加入500ml完全培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的溫箱培養(yǎng)24小時后用多聚甲醛（金錦樂化學(xué)有限公司，濃度為96%）固定，0.01%結(jié)晶紫（索萊寶公司）染色，于200倍光學(xué)顯微鏡（上海比目儀器有限公司，全相顯微鏡10XB）下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取5個視野，計算平均值，每組實驗設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。②遷移實驗：將上述細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)液中，以5×104個/孔的密度加入Transwell小室上室內(nèi)，向下室加入500ml完全培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)24小時后用多聚甲醛（濃度為4%）固定，0.01%結(jié)晶紫染色，于200倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取5個視野，計算平均值，每組實驗設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。

　　1.3、統(tǒng)計學(xué)方法

　　采用SPSS15.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以%表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有顯著性。

　　2、結(jié)果

　　2.1、ZNF281在結(jié)直腸癌和癌旁正常黏膜標(biāo)本中的表達(dá)情況比較

　　ZNF281在結(jié)直腸癌標(biāo)本中陽性表達(dá)率為84.00%，在癌旁正常黏膜中陽性表達(dá)率為20.00%，且?guī)缀鯚o強(qiáng)陽性表達(dá)，比較差異具有顯著性（P＜0.05）（表1）。陰性表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（132±10）個/視野，ZNF281高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于ZNF281低表達(dá)組和ZNF281陰性表達(dá)組（P＜0.05）。

　　2.2、ZNF281對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

　　Transwell小室檢測結(jié)果提示，ZNF281高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（215±13）個/視野，ZNF281低表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（165±10）個/視野，ZNF281陰性表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（57±8）個/視野，ZNF281高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于ZNF281低表達(dá)組和ZNF281陰性表達(dá)組（P＜0.05）。

　　2.3、ZNF281對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響

　　Transwell小室檢測結(jié)果提示，ZNF281高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（418±23）個/視野，ZNF281低表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（327±18）個/視野，ZNF281陰性表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)為（132±10）個/視野，ZNF281高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于ZNF281低表達(dá)組和ZNF281陰性表達(dá)組（P＜0.05）。

　　2.4、ZNF281表達(dá)與結(jié)直腸癌各臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析

　　ZNF281表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位無相關(guān)性（P＞0.05），但ZNF281表達(dá)水平在結(jié)直腸癌不同分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Duke's分期方面均具有顯著差異（P＜0.05）（表2）。

　　3、討論

　　研究證實，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，且為多步驟、多基因突變等共同引發(fā)的疾病[8]。結(jié)直腸癌作為臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展過程也具有明顯的階段性，通常由正常的上皮經(jīng)不典型增生形成腺癌、原位癌，最后出現(xiàn)浸潤，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9，10]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前對于結(jié)直腸癌的研究已達(dá)到分子水平，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌是由多個基因變異引起的。目前被普遍認(rèn)可的結(jié)直腸癌分子途徑主要包括4條：①抗原提呈細(xì)胞—β-catenin—Tcf—Myc途徑；②HNPCC通路；③潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生—細(xì)胞不典型增生—癌變通路；④基因的過度甲基化引起雌激素失活[11-13]。

　　ZNF281為ZNF家族中的一個亞型，是真核生物中存在的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換等侵襲行為。最新研究發(fā)現(xiàn)，ZNF281在結(jié)直腸癌細(xì)胞中也有表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其可通過干預(yù)目的基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控特定基因表達(dá)的時間特異性和組織特異性，對細(xì)胞的生長、分化、凋亡及其他過程產(chǎn)生重要影響[14，15]。ZNF281具有誘發(fā)或抑制腫瘤的作用，研究發(fā)現(xiàn)ZNF281的表達(dá)通常伴有細(xì)胞的增殖，其在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中是一種可發(fā)揮促增生作用的調(diào)控因子[16，17]。但ZNF281也有一定的抑制細(xì)胞增殖的作用，研究發(fā)現(xiàn)ZNF281在前列腺癌和乳腺癌中可下調(diào)或者缺失[18]。本研究結(jié)果顯示，ZNF281在結(jié)直腸癌標(biāo)本中陽性表達(dá)率為84.00%，在癌旁正常黏膜中陽性表達(dá)率為20.00%，且?guī)缀鯚o強(qiáng)陽性表達(dá)，差異具有顯著性。ZNF281表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位均無相關(guān)性，但ZNF281表達(dá)水平在不同分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Duke's分期方面均具有顯著差異。結(jié)果提示，ZNF281在結(jié)直腸癌病變的發(fā)生、發(fā)展階段存在高表達(dá)，在一定程度上可說明ZNF281可能是影響結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的因素之一。

　　近年來，隨著人們生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷升高，該病晚期多伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。由于缺乏特異性較高的治療藥物是目前臨床治療的難點(diǎn)[19，20]，本研究通過體外侵襲與遷移實驗，了解ZNF281對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響，結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲與遷移能力方面，ZNF281高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯多于ZNF281低表達(dá)組和ZNF281陰性表達(dá)組，說明ZNF281高表達(dá)可提高結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力。因此，臨床通過抑制ZNF281的表達(dá)可能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力。

　　綜上所述，ZNF281在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平升高，且在不同病理分化程度中表達(dá)存在差異。ZNF281可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生，同時可影響癌細(xì)胞的遷移能力，可能成為治療結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)。因此，檢測ZNF281表達(dá)對結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后具有一定的臨床意義。