免疫原性預(yù)測到底靠譜不？

　　從諾和諾德的長效重組FactorVII的III期臨床被叫停，到輝瑞宣布終止PCSK9單抗bococizumab的6個(gè)III期臨床試驗(yàn)，免疫原性問題已經(jīng)成為了生物制藥中的“深水炸彈”。小編之前文章已介紹過免疫原性的產(chǎn)生原因與檢測方法（戲說抗體和蛋白藥物的免疫原性），今天就主要介紹一下臨床前免疫原性的預(yù)測。

　　免疫原性預(yù)測

　　免疫原性問題在最初的序列設(shè)計(jì)時(shí)就應(yīng)該考慮，雖然目前還沒有針對這方面的標(biāo)準(zhǔn)或建議，但是計(jì)算機(jī)T細(xì)胞表位的預(yù)測以及體外的T細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)幾乎成了免疫原性預(yù)測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

　　T表位預(yù)測  對于高親和力的ADA的產(chǎn)生，必要的一步就是治療蛋白上T細(xì)胞表位通過APCs上的MHC II類分子提呈給CD4+ T細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放與B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。因此治療性蛋白上的T細(xì)胞表位對于免疫原性有一定影響。人MHC II分子是由HLA-DR, HLA-DP,HLA-DQ等基因編碼的α/β異源二聚體，這些基因有著非常多的等位基因。一般認(rèn)為HLA-DP和HLA-DQ與過敏原引起的T細(xì)胞反應(yīng)以及ADA的形成關(guān)系不大，因此主要是HLA-DR在ADA的形成中發(fā)揮作用。T細(xì)胞表位依賴于線性肽段，長度在15-20個(gè)氨基酸，各種算法被開發(fā)出用于預(yù)測肽段與MHC II分子（主要是HLA-DR）的結(jié)合，見下圖。

　　T細(xì)胞表位預(yù)測工具

　　MAPPs assay（MHC-associated peptide proteomics）由于T細(xì)胞表位預(yù)測的是肽段與MHC復(fù)合物的結(jié)合能力，而不能夠顯示出蛋白藥在體內(nèi)被水解和提呈的情況，因此需要MAPPs實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。具體實(shí)驗(yàn)步驟見圖，簡單來說，從健康人PBMC中分離得到CD14+單核細(xì)胞，經(jīng)分化形成未成熟的DCs，再加入測試樣品刺激后形成成熟的DCs，然后用偶聯(lián)抗HLA-DR抗體的磁珠去捕獲被HLA-DR提呈的肽段，最后經(jīng)HPLC/MS鑒定。

　　MAPPs實(shí)驗(yàn)流程

　　T cell activation assay  盡管MAPPs鑒定出了所有潛在的T細(xì)胞表位，但是由于免疫顯性現(xiàn)象的存在，并不是每一個(gè)T細(xì)胞表位都能有效的引起T細(xì)胞反應(yīng)。T細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)?zāi)苡脕頇z測受試樣品最終激活T細(xì)胞的能力。簡單來說，DC細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞分別從正常志愿者的PBMC中分離出來，在體外培養(yǎng)（即DC：CD4 Assay），也可以直接使用PBMCs（即Whole PBMC Assay）。加入受試樣品后，DC細(xì)胞能夠提呈T細(xì)胞表位從而激活CD4+ T細(xì)胞。T細(xì)胞的激活可以通過多種方式來定量檢測，例如通過3H-胸苷的組裝來測定T細(xì)胞增殖，或者通過enzyme linked immunospot (ELISpot) 實(shí)驗(yàn)來檢測IL-2的分泌。此外，最近通過流式技術(shù)分析T細(xì)胞上CD25的表達(dá)量也被用來檢測T細(xì)胞的激活。這兩種方法中，Whole PBMC Assay更靈敏，但是受試藥品可能干擾T細(xì)胞的激活，而在DC：CD4 Assay中，DC與T細(xì)胞的比例并不是正常生理狀態(tài)，因此會有更高的背景值。

　　DC: CD4 T細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)流程

　　因?yàn)槿梭w內(nèi)的免疫反應(yīng)過于復(fù)雜，從預(yù)測的T細(xì)胞表位到體外的T細(xì)胞激活就存在著很大差異。在了解了免疫原性預(yù)測的方法之后，不禁會有個(gè)想法，免疫原性預(yù)測到底靠譜不？預(yù)測結(jié)果與實(shí)際臨床的免疫原性發(fā)生率有相關(guān)性么？

　　Secukinumab的免疫原性預(yù)測

　　為此，諾華的科學(xué)家們研究了Secukinumab與其他一些用于自身免疫疾病的抗體，對比了它們的免疫原性預(yù)測結(jié)果與實(shí)際臨床免疫原性發(fā)生率。

　　幾種單抗的ADA發(fā)生率

　　他們通過MAPPs實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了在Secukinumab和Ustekinumab中存在著更少的潛在CD4+ T細(xì)胞表位。

　　各抗體相對于adalimumab的MAPPs Cluster

　　同時(shí)在T細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)中，Secukinumab和Ustekinumab也表現(xiàn)出了更低的T細(xì)胞激活響應(yīng)率。這些結(jié)果都顯示了免疫原性預(yù)測結(jié)果與臨床免疫原性發(fā)生率有相關(guān)性。

　　各抗體的T細(xì)胞激活響應(yīng)率

　　Vatreptacogalfa的免疫原性預(yù)測

　　諾和諾德也在前不久也對他們的長效重組FactorVII，Vatreptacog alfa進(jìn)行了免疫原性預(yù)測。Vatreptacog alfa與天然FactorVII相比，只發(fā)生了三個(gè)氨基酸替換，V158D,E296V以及M298Q。在臨床III期實(shí)驗(yàn)中，8/72(11%)的患者出現(xiàn)了ADA，且4人ADA能與內(nèi)源的FactorVII結(jié)合。通過結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及計(jì)算機(jī)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)含有E296V和M298Q的肽段與HLA-DR的親和力比V158D高的多，且高親和力是對于某些特定的HLA-DR分子而非所有的。

　　含有突變的肽段與HLA-DR分子的結(jié)合能力

　　接下來的MAPPs實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，兩次實(shí)驗(yàn)12/17(70%)和4/12(30%)的人中出現(xiàn)了含E296V與M298Q的肽段，而沒有出現(xiàn)V158D肽段，并且這些人的HLA-DR分型與之前預(yù)測的高親和力HLA-DR分型吻合。在T細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)中，含E296V或/與M298Q的肽段都能有效的激活T細(xì)胞，而V158D不能。這些結(jié)果都表明了E296V與M298Q可能是引起Vatreptacog alfa ADA的主要原因。此外，臨床實(shí)驗(yàn)中的7個(gè)ADA陽性病人與18個(gè)ADA陰性病人進(jìn)行了HLA的分型檢測，發(fā)現(xiàn)7個(gè)ADA陽性病人的HLA-DR分型都與含E296V與M298Q的肽段有較強(qiáng)的親和力，而在18個(gè)ADA陰性病人中，只有8個(gè)（44%）病人含有強(qiáng)親和力的HLA-DR分型。雖然統(tǒng)計(jì)數(shù)目較少，也從一定程度上說明了強(qiáng)的T細(xì)胞表位可能與ADA的發(fā)生率存在聯(lián)系。

　　含有不同突變肽段的T細(xì)胞激活響應(yīng)率

　　但是值得注意的是，人體中免疫反應(yīng)遠(yuǎn)比T細(xì)胞激活復(fù)雜，臨床前免疫原性預(yù)測結(jié)果和臨床試驗(yàn)ADA的發(fā)生率并不是線性相關(guān)的。除去分子序列，治療性蛋白的CMC，制劑，病人的狀態(tài)，給藥方式等都會給免疫原性造成影響。還有各抗體的臨床ADA發(fā)生率，由于測量方法的不同，取樣時(shí)間的不同，不具備可比性。對于實(shí)驗(yàn)本身，比如T細(xì)胞激活的響應(yīng)率都很低，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會存在較大的變異性。而且T細(xì)胞的激活是與HLA-DR的分型密切相關(guān)的，因此需要實(shí)驗(yàn)樣本盡可能多，符合人口的分布。最后免疫原性預(yù)測只能用于評價(jià)相對的免疫原性高低，如上面secukinumab的例子，在MAPPs和T細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)中，adalimumab和infliximab的結(jié)果就是相反的，但是和secukinumab和ustekinumab相比，大趨勢還是存在的。因此能利用免疫原性預(yù)測幫我們篩選掉高ADA風(fēng)險(xiǎn)的分子就非常有意義。

　　此外，之前的報(bào)道發(fā)現(xiàn)Vatreptacog alfa中任意一個(gè)單突變都不能夠像Vatreptacog alfa本身一樣競爭其與ADA的結(jié)合，說明V158D,E296V以及M298Q三個(gè)突變對于ADA的生成都有貢獻(xiàn)。這也暗示了除了T細(xì)胞表位，B細(xì)胞表位在可能ADA發(fā)生過程中也起到作用。由于B細(xì)胞表位主要依賴于構(gòu)象結(jié)構(gòu)，單獨(dú)的B細(xì)胞表位不足以引起B(yǎng)細(xì)胞的激活，因此很難通過B細(xì)胞表位來預(yù)測免疫原性。同時(shí)與傳統(tǒng)的老鼠或猴子模型相比，HLA轉(zhuǎn)基因或者人免疫系統(tǒng)移植的老鼠可能在免疫原性預(yù)測上更有潛力，但是如何保證HLA的多樣性與降低成本仍然是難題。希望在將來這些方法能夠有所突破。

　　單獨(dú)V158D, E296V, M198Q突變的FVIIa不能夠完全競爭Vatreptacogalfa與ADA的結(jié)合

　　總的來說，現(xiàn)階段精確預(yù)測臨床免疫原性發(fā)生率是不可能實(shí)現(xiàn)的，但是臨床前免疫原性預(yù)測（T/B表位預(yù)測以及體外T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）與臨床免疫原性發(fā)生率表現(xiàn)出的近似相關(guān)性，能夠幫助我們減少高免疫原性帶來的風(fēng)險(xiǎn)，盡量避免這顆“深水炸彈”。希望能夠盡早開發(fā)出更精確的方法，也希望人們引起重視，畢竟三期臨床失敗，不管對于藥企、接受臨床試驗(yàn)的志愿者還是急切盼望新藥的病人，都是不能承受之重。