腫瘤免疫治療的耐藥機制

　　前言

　　自從2014年anti-PD-1單抗Opdivo和Keytruda被批準上市以來，腫瘤免疫治療的熱浪席卷全球，取得了空前的成功。除Opdivo和Keytruda外，還有anti-CTLA-4單抗Yervoy以及anti-PD-L1單抗Tecentriq獲FDA批準上市。這些免疫檢查點抑制劑在黑色素瘤，非小細胞肺癌，腎細胞癌，霍奇金淋巴瘤，膀胱癌等多種癌癥中表現(xiàn)出了令人欣喜的療效，其中Keytruda還在2016年獲批一線治療PD-L1高表達(>50%)的非小細胞肺癌。然而免疫檢查點抑制劑并不是萬能的“神藥”，也存在其缺陷，其中一項就是由于耐藥性而導致的響應率不高與腫瘤復發(fā)再進展。腫瘤免疫耐藥可分為原發(fā)性耐藥(primary resistance)，適應性免疫耐藥(adaptive immune resistance)以及獲得性耐藥(acquired resistance)。在anti-PD-1療法治療黑色素瘤中，約有60%的患者不響應(primary resistance)，還有一部分患者在初始響應后腫瘤出現(xiàn)了再進展。本文就詳細介紹下腫瘤免疫耐藥的機制。

　　黑色素瘤患者對anti-PD-1療法的臨床響應

　　導致原發(fā)性/繼發(fā)性耐藥的腫瘤內(nèi)在原因

　　這些原因主要是腫瘤細胞上特定基因或通路的表達或上調(diào)，從而導致腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤以及功能受到抑制。具體如下:

　　導致免疫療法耐藥的腫瘤內(nèi)在原因

　　MAPK通路的激活與或PTEN表達的缺失而引起的PI3K通路的增強。癌基因信號通過MAPK通路導致VEGF與IL-8的產(chǎn)生，從而抑制T細胞的招募與功能。此外，在多種腫瘤中，腫瘤抑制基因PTEN表達缺失從而PI3K通路增強，這與IFNγ，顆粒酶B的基因表達量降低以及腫瘤浸潤CD8+ T細胞的數(shù)目減少是高度相關(guān)的。

　　WNT/β-catenin信號通路的持續(xù)表達。癌基因信號通過穩(wěn)定β-catenin導致WNT信號通路持續(xù)激活，從而將T細胞排除在腫瘤之外。在人Non-T-cell-inflamed的黑色素瘤中，腫瘤內(nèi)在的β-catenin信號基因高度表達，且在腫瘤微環(huán)境中缺少T細胞與CD103+ DC細胞。

　　腫瘤上PD-L1的高表達。腫瘤上高表達的某些配體如PD-L1，會抑制抗腫瘤T細胞的應答。多種機制可能導致PD-L1高表達，包括PTEN的缺失或PI3K/AKT的突變，EGFR突變，MYC過表達，CDK5基因破壞以及PD-L1基因3’-UTR的截短。目前還不知道PD-L1的高表達是否會對anti-PD-1/PD-L1的響應有影響，但是它會影響其他的腫瘤免疫療法。

　　IFNγ信號通路的缺失。由腫瘤特異的T細胞產(chǎn)生的IFNγ，能夠識別腫瘤細胞或抗原遞呈細胞上的相應受體，從而發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫響應。IFNγ能夠增強MHC分子的表達，從而增強腫瘤抗原提呈作用。IFNγ也能夠招募其他的免疫細胞，或者直接抑制腫瘤細胞的增殖，促進其凋亡。因此腫瘤細胞上IFNγ通路相關(guān)蛋白，如IFNγ受體IFNGR1與IFNGR2，IFNγ受體鏈JAK1與JAK2，STATs，IRF1等突變與缺失，都會導致對免疫檢查點抑制劑的耐藥。

　　缺少腫瘤抗原，從而導致T細胞無法激活。免疫療法依賴于腫瘤抗原特異的T細胞。在人黑色素瘤，腎細胞癌，非小細胞肺癌中，DNA突變頻率高，腫瘤免疫原性更強，因而對anti-PD-1療法響應更好。而在胰腺癌以及前列腺癌中，DNA突變頻率低，腫瘤免疫原性低，對anti-PD-1療法響應差。

　　抗原提呈機制存在缺陷。在某些情況下，由于抗原加工過程中的蛋白酶體成員，轉(zhuǎn)運蛋白，MHC本身以及beta-2-微球蛋白(B2M)的功能缺陷，會導致抗原提呈機制不能有效地將腫瘤抗原提呈到細胞表面。B2M在HLAI家族的折疊與轉(zhuǎn)運到細胞膜的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，若其喪失功能，則CD8+T細胞失去了識別功能。

　　存在一系列特定基因的表達。在對PD-1療法沒有響應的腫瘤中，有一些基因表達被富集，被稱為innate anti-PD-1 resistance signature，或IPRES。這些基因與間葉細胞的轉(zhuǎn)化，全能型以及傷口愈合相關(guān)，且更傾向于表達在胰腺癌等對PD-1不響應的腫瘤中。

　　導致原發(fā)性/繼發(fā)性耐藥的腫瘤外部原因

　　這些原因是由于腫瘤微環(huán)境中一些成員發(fā)揮抗癌免疫響應的抑制作用，主要包括調(diào)節(jié)T細胞Tregs，髓樣抑制細胞MDSCs，M2巨噬細胞，其他的抑制性免疫檢查點與抑制性細胞因子等。

　　導致免疫療法耐藥的腫瘤外部原因

　　Tregs。Tregs能通過分泌抑制性細胞因子或者通過直接的細胞接觸來抑制效應T細胞Teffs的響應。許多人腫瘤中發(fā)現(xiàn)了浸潤的Tregs，且鼠模型中去除腫瘤微環(huán)境中的Tregs能夠顯著提高免疫響應。由于CTLA-4在Tregs上高表達，anti-CTLA-4能夠顯著提高Teffs/Tregs的比例，從而提高腫瘤對免疫療法的響應。

　　Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs)。MDSCs在多種病理條件包括腫瘤，發(fā)揮著免疫響應調(diào)節(jié)因子的作用。人MDSCs表達CD11b+與CD33+，但是不表達HLA-DR以及系種特異的抗原CD3，CD19與CD57。MDSCs能夠促進血管生長，腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中MDSCs的存在與降低的生存率以及免疫檢查點抑制劑療法的響應率相關(guān)。目前實驗中使用PI3Kγ抑制劑來調(diào)節(jié)巨噬細胞功能，在老鼠模型中，PI3Kγ抑制劑與anti-PD-1聯(lián)用表現(xiàn)出了良好的腫瘤抑制效果。

　　M2 macrophages。腫瘤相關(guān)的巨噬細胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)也能夠影響免疫治療的響應。TAMs包括M1巨噬細胞和M2巨噬細胞，在大多數(shù)情況下M2巨噬細胞占TAMs的大多數(shù)。其中M1巨噬細胞能夠高表達IL-12，IL-23，MHC以及B7家族分子來促進抗原提呈與Th1細胞的激活，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用；而M2巨噬細胞能夠分泌抑制性細胞因子IL-10與TGF-β，從而抑制免疫響應與促進腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。臨床上TAMs的數(shù)目越多，腫瘤預后就越差。臨床前實驗使用巨噬細胞集落刺激生長因子受體1(CSF-1R)的抑制劑，能夠顯著減少TAMs數(shù)目，抑制腫瘤生長。CSF-1R抑制劑與anti-CTLA4或anti-PD1再加上吉西他濱聯(lián)用，能夠有效緩解單獨anti-CTLA-4或anti-PD1不響應的鼠胰腺癌模型。

　　其他的抑制性免疫檢查點。除了PD-1與CLTA-4，T細胞上還存在其他的抑制性免疫檢查點，包括TIM-3，LAG-3，BTLA，TIGIT，和VISTA等。具體可見小編之前的文章《免疫檢查點抑制劑的抗體藥總結(jié)》。

　　免疫抑制細胞因子與免疫抑制分子。腫瘤或者巨噬細胞會釋放一些免疫抑制細胞因子或者免疫抑制分子來減弱局部的抗腫瘤免疫反應。TGF-β能夠促進血管生成，刺激Tregs從而發(fā)揮免疫抑制作用。在多種腫瘤中，高水平的TGF-β都伴隨著極差的預后。臨床前實驗使用TGF-β受體激酶抑制劑與anti-CTLA-4聯(lián)用，或者放療與TGF-β抑制劑都顯示出了較好的腫瘤抑制效果。在細胞外，CD39能夠?qū)TP水解成AMP，進一步被胞外核苷酶CD73加工為免疫抑制分子腺苷adenosine。Adenosine能夠通過T細胞上的A2A受體抑制T細胞的增殖與細胞毒活性，也能通過腫瘤細胞上的A2B受體促進腫瘤轉(zhuǎn)移。多種類型的腫瘤中，CD73的高表達伴隨著較差的預后，且會影響anti-PD-1的效果。此外，IFNγ會促進免疫抑制分子IDO的表達，IDO能直接負調(diào)控效應T細胞的功能。

　　趨化因子與趨化因子受體。某些特異的趨化因子與趨化因子受體在MDSCs和Tregs往腫瘤微環(huán)境的運輸過程中起到重要作用。腫瘤細胞能夠分泌配體CCL5，CCL7和CXCL8，通過結(jié)合MDSCs上表達的CCR1及CXCR2受體，從而將MDSCs吸引至腫瘤微環(huán)境中。CCR4在Tregs上高表達，anti-CCR4能夠有效抑制T細胞的招募并通過ADCC效應減少Tregs的數(shù)目。此外CXCR4是CXCL12的受體，CXCL12能夠通過影響Tregs定位等多種方式發(fā)揮免疫抑制作用。

　　腫瘤浸潤細胞上CD28的表達。CD28是T細胞的共刺激分子，對于T細胞的激活，增殖和存活起到關(guān)鍵作用。在人出生時，所有T細胞都會表達CD28，但是CD28的表達量會隨著年齡的增加而下降，80歲時會有10-15%的CD4+ T細胞以及50-60%的CD8+ T細胞缺失CD28表達。CD28-T細胞產(chǎn)生的主要原因是重復的抗原刺激。CD28表達的消失只存在與人和靈長動物中，在鼠中并沒有被發(fā)現(xiàn)。在今年3月9日的《Science》上，發(fā)表了來自Emory疫苗中心的研究工作，他們發(fā)現(xiàn)CD28對于耗盡的CD8+T細胞(Exhausted CD8+ T Cell)的再激活是必須的。在老鼠模型中，阻斷CD28-B7共刺激通路，會影響腫瘤特異CD8+T細胞的增殖和激活，降低對anti-PD-1/PD-L1療法的響應。在經(jīng)過anti-PD-1治療的NSCLC病人中，增殖的CD8+T細胞(高Ki-67表達)大都為PD-1陽性，且被激活(高HLA-DR，CD38表達)。和鼠模型中一樣，這些增殖的CD8+T細胞大都是CD28陽性的，說明了CD28共刺激對于腫瘤浸潤的PD-1+CD8+T細胞的增殖與再激活是至關(guān)重要的。因此，CD28可以用作預測anti-PD-1療法響應程度的分子標記。

　　獲得性耐藥的產(chǎn)生原因

　　腫瘤免疫療法的一個顯著特點是腫瘤響應的時間長，但是在使用anti-CTLA-4或anti-PD-1治療黑色素瘤的患者中，大約有1/4-1/3的患者在經(jīng)歷初始響應后出現(xiàn)了腫瘤進展，即獲得性耐藥。獲得性耐藥的產(chǎn)生可能是因為在治療過程中出現(xiàn)了上文所述的那些原因，包括T細胞功能的喪失，腫瘤抗原提呈出現(xiàn)缺陷以及其他一些新突變的產(chǎn)生。例如，在一類較晚獲得anti-PD-1耐藥性的病人中，發(fā)現(xiàn)了B2M的突變，從而導致抗原提呈機制缺陷。在另兩例獲得性耐藥腫瘤中，發(fā)現(xiàn)了IFNγ通路中JAK1或JAK2發(fā)生了突變。

　　在2016年《nature communication》上，有研究者發(fā)現(xiàn)anti-PD-1耐藥性的產(chǎn)生與抑制性免疫檢查點TIM-3的的表達量升高密切相關(guān)。在兩個老鼠腫瘤模型中，耐藥后與給藥前相比，腫瘤浸潤的T細胞而非外周血或脾臟T細胞上的TIM-3表達量顯著上調(diào)，且TIM-3表達量上調(diào)的主要是那些結(jié)合了anti-PD-1抗體的T細胞。需注意的是TIM-3表達量升高是anti-PD-1療法特異的，因為anti-CTLA-4中并未檢測到類似現(xiàn)象。此外，腫瘤細胞上TIM-3配體Galectin-9的表達量也顯著升高。當anti-PD-1療法出現(xiàn)耐藥后，聯(lián)用anti-TIM-3，顯著提高了生存率。有意思的是，當anti-PD-1和anti-TIM-3聯(lián)用被耐藥，腫瘤重新進展時，那些結(jié)合了anti-PD-1和anti-TIM-3抗體的T細胞上，其他的抑制性免疫檢查點如CTLA-4，LAG-3的表達量明顯升高。這說明了腫瘤浸潤T細胞的抑制性免疫調(diào)節(jié)是動態(tài)變化的，存在著補償效應。最后，在兩例對anti-PD-1療法獲得性耐藥的NSCLC病人腫瘤樣本中，也觀察到了TIM-3而非其他抑制性免疫檢查點的表達量顯著升高。這些結(jié)果說明了anti-PD-1和anti-TIM-3聯(lián)用是對于那些anti-PD-1療法獲得性耐藥病人的一個良好策略。

　　Anti-TIM-3與anti-PD-1聯(lián)用能顯著抑制腫瘤進展

　　應對腫瘤免疫耐藥的方案

　　隨著精準醫(yī)療的概念深入人心，鑒定出有效的生物標記來預測免疫療法的響應與耐藥非常有意義。這些生物標記包括基因組標記，免疫調(diào)節(jié)基因表達量以及浸潤CD8+T細胞的密度和分布等免疫標記。相對于之前使用的治療前本底水平的生物活檢(pre-treatment baseline biopsies)，縱向的多次活檢(longitudinal biopsies)可能會更好地預測腫瘤對治療的響應。最近研究表明相比于治療前的標記，治療早期樣本的免疫標記有更好地預測效果。

　　此外，應對腫瘤免疫耐藥的一個有效方法就是聯(lián)合用藥。Anti-PD-1與anti-CTLA-4聯(lián)合用藥治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤顯示出了更高的響應率。Anti-PD1與anti-TIM-3/anti-LAG-3/anti-TIGIT的聯(lián)合用藥在臨床前實驗都展示出了極佳的效果，臨床試驗也正在進行中。除了免疫檢查點抑制劑之間聯(lián)用，免疫檢查點抑制劑與共刺激因子激動劑，靶向藥，放療化療以及表觀遺傳修飾因子的聯(lián)用都在探索之中。希望未來免疫檢查點抑制劑能夠聯(lián)合一些便宜的非專利藥，來減少聯(lián)合用藥帶來的高花費。

　　腫瘤免疫治療的聯(lián)用方案

　　結(jié)語

　　腫瘤免疫治療改變了腫瘤治療的格局，但是其耐藥性限制了它的療效與應用。希望在接下來的幾年里能開發(fā)出合適的生物標記來指導個性化用藥，從而提高免疫治療的響應。此外，通過聯(lián)合用藥，減少原發(fā)性耐藥帶來的副作用，提高免疫治療的響應率，爭取在一些anti-PD-1單一療法不起作用的癌癥類型，如胰腺癌和前列腺癌上取得成功。